丁長河，張夢涵

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院 河南省天然色素制備重點實驗室，河南 鄭州 450001）

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的典型代表，主要有全反式、9-順式、13-順式及15-順式4種形式。大量研究表明，β-胡蘿卜素能轉化為維生素A，具有抗氧化、預防癌癥、預防心血管疾病、提高免疫系統等功能[1-3]。β-胡蘿卜素的主要來源有天然物提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法。天然物提取法受產品原料、氣候、運輸條件的制約，成本高，產量較低；化學合成法存在一定的危害。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法易培養(yǎng)，產量高，產品具有順式和反式混合體，更加安全，因此得到廣泛的應用[4-6]。

產β-胡蘿卜素的微生物主要有三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）[7]、粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa）[8]、紅酵母（Rhodotorula）[9-10]、膠紅酵母（Rhodotorula mucilagi nosa）[11]、鹽藻類等[12-13]。HE Z J等[14]研究發(fā)現，乙烯能夠導致三羧酸循環(huán)代謝流的下降和乙酰輔酶A的積累，以及甲羥戊酸途徑關鍵基因的轉錄上調，進而促進三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素；向夢雄等[15]研究發(fā)現，一定濃度的Zn2+或Mn2+對Blakeslea trispora合成β-胡蘿卜素有促進作用，而不同濃度的Fe3+、Cu2+和Ca2+對β-胡蘿卜素合成存在抑制作用；樊竹青等[16]從云南撫仙湖湖水中分離出379株酵母菌，研究發(fā)現“紅色酵母”具有較強的產類胡蘿卜素的能力；孔維寶等[17]從土壤中篩選出一株產類胡蘿卜素的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）K-1，并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，總類胡蘿卜素含量達（180.14±2.45）μg/g干菌體，具有高產類胡蘿卜素的潛能；BUZZINI P等[18]研究發(fā)現，Al3+和Zn2+對牧草紅酵母（Rhodotorula graminis）合成β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素有促進作用，而Zn2+和Mn2+對紅酵母烯和紅酵母紅素產生了抑制作用。

目前，能產高純度β-胡蘿卜素的菌種還十分有限，合成高純度β-胡蘿卜素的菌株選育仍然是未來研究的重點方向之一。本研究以前期從土壤中分離得到的一株高產高純度β-胡蘿卜素的菌株S3-1為研究對象，采用分子生物學技術對其進行鑒定，并通過單因素試驗及正交試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產高純度β-胡蘿卜素提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株S3-1：本實驗室前期從土壤中分離、純化并保藏。

1.1.2試劑

酵母浸粉、蛋白胨、麥芽糖（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；玉米漿：上海方畦儀器有限公司；β-胡蘿卜素（純度≥95%）：德國Sigma公司；Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司。

活化培養(yǎng)基：含0.1 g/L氯霉素的PDA培養(yǎng)基，pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、無水氯化鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

FA2004W電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；EL20-K pH計：美國梅特勒托利多公司；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-2A數顯氣浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；TDZ7-WS離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株S3-1的鑒定

按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株S3-1的基因組，以其為模板，采用真菌核糖體ITS基因片段的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系：模板基因組0.5 μL，10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+）0.5 μL，2.5mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各取0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補至25 μL。PCR擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)30次；72℃再延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發(fā)育樹，自展值為1 000。

1.3.2 菌株S3-1產β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化

菌株活化：將菌株S3-1劃線于活化培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)3 d。種子培養(yǎng)：挑取活化培養(yǎng)基上的單菌落接種于裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對數期。發(fā)酵培養(yǎng)：按6%（V/V）的接種量將種子液接種于裝液量為40 mL/250 mL的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)84 h。參考楊文等[19]的方法，采用酸熱法進行破壁，丙酮進行提取，提取至菌體變白，合并提取液，提取過程盡量避光。

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別考察碳源種類（葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油）及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉+蛋白胨）及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、硫酸鎂添加量（0、0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對菌體生長和β-胡蘿卜素產量的影響。根據β-胡蘿卜素的產量和純度篩選影響顯著的因子和最佳水平，進行4因素3水平正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 菌株S3-1產β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of fermentation process of β-carotene production by strain S3-1

1.3.3 測定方法

生物量的測定：發(fā)酵液經離心、水洗后，105℃烘干至恒質量，稱菌體質量，以g/L表示。

β-胡蘿卜素含量的測定：參考魏娜等[20]的方法，采用高效液相色譜法對β-胡蘿卜素進行定性定量分析。HPLC條件：檢測波長454nm，柱溫28℃，流動相A是體積分數90%乙腈，B是體積分數100%乙酸乙酯。梯度洗脫：0～5 min，B從0升至50%；5.01min，B升至53%；5.01～10 min，B保持53%；10～15.01 min，B升至54%；15.01～20 min，B降至0。

β-胡蘿卜素純度的測定[20]：通過峰面積對其他色素定量，并計算β-胡蘿卜素所占比例。

1.3.4 數據統計與分析

采用MSExcel2016進行基礎數據統計；采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析；采用Duncan法進行組間多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌株S3-1的鑒定

菌株S3-1的PCR擴增產物的電泳圖譜見圖1。由圖1可知，PCR擴增產物堿基長度約為574 bp，與目的基因堿基長度相符，進行測序。

圖1 菌株S3-1 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of strain S3-1

將菌株S3-1的ITS測序結果提交至NCBI的GenBank數據庫中進行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，構建系統發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株S3-1與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）JQ2-1聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定菌株S3-1為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。韓梅等[21]研究發(fā)現，S.pararoseus所產的β-胡蘿卜素以全反式結構為主，全反式結構約占總β-胡蘿卜素的60%，順式結構主要有13-順和9-順β-胡蘿卜素。

圖2 基于ITS基因序列菌株S3-1的系統發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain S3-1 based on ITS gene sequences

2.3 菌株S3-1產β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 碳源種類對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

不同微生物對碳源的需求不同，不同碳源對發(fā)酵產物的合成可能產生不同的作用。因此，比較8種不同碳源對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響，結果見表2。由表2可知，當以蔗糖為碳源時，生物量最高，為（13.21±0.08）g/L，與葡萄糖、果糖、可溶性淀粉無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于乳糖、麥芽糖、甘油（P＜0.05）；當以葡萄糖為碳源時，β-胡蘿卜素產量及純度最大（P＜0.05），分別為（1.95±0.26）mg/L、（53.91±1.47）%。因此，選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

表2 碳源種類對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 2 Effect of carbon sources types on β-carotene production by strain S3-1

2.3.2 葡萄糖添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

研究葡萄糖添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響，結果見表3。由表3可知，當葡萄糖添加量為40 g/L時，生物量最高，為（15.10±1.19）g/L；當葡萄糖添加量為30 g/L時，β-胡蘿卜素產量及純度達到最高，分別為（2.17±0.35）mg/L、（54.80±1.45）%。因此，確定葡萄糖的最佳添加量為30 g/L。

表3 葡萄糖添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 3 Effect of glucose addition on β-carotene production by strain S3-1

2.3.3 氮源種類對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

微生物利用氮元素在細胞內合成氨基酸和堿基，進而合成蛋白質、核酸等細胞成分，以及含氮的代謝產物，對微生物的生長發(fā)育有重要的意義[22]。有機氮源中營養(yǎng)比較豐富，除了含有一定比例的蛋白質、多肽及游離氨基酸外，還含有少量的糖類、脂類、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分[22]。由于微生物可以直接從培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)成分，所以有機氮源更有利于微生物的生長。研究不同有機氮源對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響，結果見表4。由表4可知，當10g/L酵母浸粉和20 g/L蛋白胨作為氮源時，生物量最高，達到（14.49±0.32）g/L；當30 g/L酵母浸粉作為氮源時，β-胡蘿卜素產量和純度最高，分別為（2.62±0.06）mg/L、（60.41±2.62）%。因此，選擇酵母浸粉作為最優(yōu)氮源。

表4 有機氮源種類對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 4 Effect of organic nitrogen source types on the β-carotene production by strain S3-1

2.3.4 酵母浸粉添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

研究酵母浸粉添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響，結果見表5。由表5可知，當酵母浸粉添加量在10～60g/L范圍內，β-胡蘿卜素產量隨著酵母浸粉添加量的增加呈現先升高后降低的趨勢。當酵母浸粉添加量為20 g/L時，菌株S3-1的生物量、β-胡蘿卜素產量最高，分別為（14.32±0.25）g/L、（2.01±0.21）mg/L，且顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此，確定酵母浸粉最佳添加量為20 g/L。

表5 酵母浸粉添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 5 Effect of yeast extract addition on β-carotene production by strain S3-1

2.3.5 硫酸鎂添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

表6 硫酸鎂添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 6 Effect of MgSO4addition on the β-carotene production by strain S3-1

MgSO4提供Mg2+，Mg2+是重要的輔酶和很多酶的激活劑，也是細胞色素的成分[22]。研究MgSO4添加量對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響，結果見表6。由表6可知，當MgSO4添加量為1.2 g/L時，菌體生物量最大，為（16.12±0.18）g/L；當MgSO4添加量為0.3 g/L時，β-胡蘿卜素產量最高，為（1.85±0.19）mg/L。因此，確定MgSO4最佳添加量為0.3 g/L。

2.3.6 初始pH值對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響

初始pH值對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響結果見表7。由表7可知，當初始pH值為5.0時，β-胡蘿卜素產量最高，為（2.36±0.24）mg/L。當初始pH值為5.5時，生物量最高，但與初始pH 5.0無明顯差異（P＞0.05）。LUO H等[23]研究發(fā)現，當初始pH值在4.0～7.0范圍內，初始pH值較高的培養(yǎng)基有利于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞生長，而相對較低的初始pH值有利于β-胡蘿卜素的形成。

表7 初始pH值對菌株S3-1產β-胡蘿卜素的影響Table 7 Effect of initial pH on β-carotene production by strain S3-1

2.4 菌株S3-1產β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇葡萄糖添加量（A）、酵母浸粉添加量（B）、初始pH值（C）及MgSO4添加量（D）為考察因素，β-胡蘿卜素產量、純度為考察指標，進行4因素3水平的正交試驗，結果與分析見表8，方差分析見表9和表10。

表8 菌株S3-1產β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis orthogonal experiments of optimization of fermentation process of β-carotene production by strain S3-1

續(xù)表

試驗號 A B C D β-胡蘿卜素產量/（mg·L-1） 純度/%產量K1 K2 K3 R1 1.973 2.657 2.808 0.835 2.388 2.432 2.618 0.230 2.469 2.446 2.523 0.077最優(yōu)組合純度K1 K2 K3 R1 36.497 52.493 58.117 21.620 48.943 51.213 46.950 4.263 49.437 48.500 49.170 0.937最優(yōu)組合2.206 2.511 2.721 0.515 A3B3C3D3 47.410 50.397 49.300 2.987 A2B3C2D1

表9 以β-胡蘿卜素產量為考察指標的正交試驗結果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results using β-carotene production as evaluation index

表10 以β-胡蘿卜素純度為考察指標的正交試驗結果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiments results using β-carotene purity as evaluation index

由表8可知，影響β-胡蘿卜素產量的因素主次順序為酵母浸粉＞葡萄糖＞初始pH值＞MgSO4，最佳組合為A3B3C3D3，即葡萄糖40 g/L、酵母浸粉添加量30 g/L、初始pH值5.5、MgSO4添加量0.4 g/L；而影響純度的因素主次順序為酵母浸粉＞初始pH值＞葡萄糖＞MgSO4，最佳組合為A2B3C2D1，即葡萄糖添加量30 g/L、酵母浸粉添加量30 g/L、初始pH值5.0、MgSO4添加量0.2 g/L。

由表9可知，酵母浸粉對β-胡蘿卜素產量的影響極顯著（P＜0.01），葡萄糖對結果影響顯著（P＜0.05）。由表10可知，酵母浸粉、葡萄糖和初始pH值對β-胡蘿卜素純度的影響均為極顯著（P＜0.01），其中酵母浸粉影響最大，其次為初始pH值，最后是葡萄糖。

采用綜合平衡法[24]進行多指標影響分析，獲得能兼顧β-胡蘿卜素產量和純度兩個指標均衡的優(yōu)化方案。由此分析：首先酵母浸粉（B）對β-胡蘿卜素純度和產量的影響最大，且均以B3水平最好，因此確定B3為最優(yōu)水平。葡萄糖（A）對β-胡蘿卜素產量的影響大小排第二位，且以A3水平最好，對β-胡蘿卜素純度的影響排第三位，且以A2水平最好，但取A2時，產量比A3減小了7.7%，因此確定A3為最優(yōu)水平。初始pH值（C）對β-胡蘿卜素產量的影響大小排第三位，且以C3水平最好，但對β-胡蘿卜素純度的影響排第二位，且以C2水平最好，因此，確定C2為最優(yōu)水平。硫酸鎂（D）對β-胡蘿卜素產量和純度的影響均最小，分別以D3和D1水平最好。因此，對A3B3C2D1和A3B3C2D3組合進行重復試驗，結果表明，組合A3B3C2D1的生物量、β-胡蘿卜素產量和純度均較高，分別為21.03 g/L、3.08 mg/L、60.01%，生物量、β-胡蘿卜素產量較未優(yōu)化前分別提高了75.94%、43.44%。因此，確定菌株S3-1產β-胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵工藝為A3B3C2D1。

3 結論

本研究以土壤中篩選出的一株高產高純度β-胡蘿卜素的菌株S3-1為研究對象，采用分子生物學技術鑒定其為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。通過正交試驗優(yōu)化確定菌株S3-1產β-胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵工藝：葡萄糖40 g/L、酵母浸粉30 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、無水氯化鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L、初始pH值5.0。在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，β-胡蘿卜素產量為（3.08±0.46）mg/L，純度為（60.01±2.66）%。