劉芳利，馮文倩，何沛瑩，宋育陽(yáng)，2，秦 義，2，劉延琳，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；

2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

葡萄汁中含氮化合物的含量和比例，因葡萄品種、栽培方式、采收時(shí)間等因素的不同而存在差異[1-2]。氮源的存在形式包括銨離子、氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，但是只有銨離子和一些氨基酸可以被酵母吸收利用，此類(lèi)氮源稱為酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）[3-4]。在無(wú)其他限制因素情況下，YAN決定酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度和酒精發(fā)酵速率[1，5]，影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝，導(dǎo)致葡萄酒中化學(xué)成分的差異[6-7]。

在葡萄酒釀造過(guò)程中，釀酒酵母除了進(jìn)行酒精發(fā)酵外，還會(huì)利用其自身的硫酸鹽還原途徑，代謝生成H2S。H2S具有臭雞蛋氣味，且閾值很低，會(huì)嚴(yán)重?fù)p壞葡萄酒感官質(zhì)量[8]。釀酒酵母的基因背景差異是造成H2S釋放量不同的主要原因[9]。同時(shí)，還有很多因素影響酵母產(chǎn)H2S，如碳源、氮源、硫源、溫度等不同的培養(yǎng)條件[10]。因此，釀酒酵母代謝產(chǎn)H2S受菌株遺傳背景和環(huán)境的雙重影響。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，發(fā)酵過(guò)程中H2S的總產(chǎn)量與發(fā)酵液中的氮含量成反比。然而，SANTIAGO M等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，添加YAN不僅不會(huì)減少H2S的產(chǎn)生，甚至在某些情況下會(huì)加劇H2S的釋放，并具有菌株依賴性。目前，最常見(jiàn)的處理H2S的方法是向葡萄醪中添加磷酸氫二銨或磷酸銨，不僅可以提高發(fā)酵速率，也能有效降低H2S的產(chǎn)量[15]。但是，若添加不當(dāng)，也會(huì)產(chǎn)生適得其反的效果[16]。因此，了解每個(gè)菌株的具體氮需求，可有效降低發(fā)酵遲滯和H2S大量生成的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

目前，葡萄酒釀造中使用的酵母多以中低產(chǎn)H2S釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主，本研究以3株本土低產(chǎn)硫化氫的野生型釀酒酵母41y5、182y12和174y1為研究對(duì)象，利用Triple M培養(yǎng)基，即模擬葡萄汁，探索不同初始YAN質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母發(fā)酵特性的影響，并對(duì)各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。旨在篩選不同初始YAN質(zhì)量濃度下低產(chǎn)或不產(chǎn)H2S的釀酒酵母，有助于本土釀酒酵母的應(yīng)用，對(duì)生產(chǎn)有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）41y5、182y12、174y1、112y4：由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院從陜西省咸陽(yáng)市涇陽(yáng)縣自然發(fā)酵葡萄醪中篩選的本土野生型低產(chǎn)H2S釀酒酵母。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、果糖、無(wú)氨基酵母氮源（yeast-nitrogen-base withoutaminoacids，YNB）（均為生化試劑）、麥角固醇、L-脯氨酸、L-精氨酸（純度均＞99%）：北京索萊寶科技有限公司；L-（+）酒石酸、L-（-）蘋(píng)果酸、無(wú)水檸檬酸（純度均＞99%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；水解酪蛋白、半乳糖（純度均＞99%）：美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L；固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L，115℃高壓滅菌30 min。

Triple M培養(yǎng)基（模擬葡萄汁）：參照MARTíNEZMORENO R等[18]的方法配制。Triple M培養(yǎng)基中的氮源質(zhì)量濃度為300 mg/L（包括120 mg/L無(wú)機(jī)銨鹽與180 mg/L混合氨基酸），參照BELTRAN G等[3]的方法將Triple M培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)銨鹽與混合氨基酸按同樣比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，將初始可同化氮的質(zhì)量濃度分別調(diào)整為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L，分別簡(jiǎn)寫(xiě)為N100、N200、N300和N400。Triple M培養(yǎng)基的正常pH值為3.25，因此，將N300的Triple M培養(yǎng)基的初始pH值用4 mol/L氫氧化鉀分別調(diào)整為3.2、3.6和4.0。

1.2 儀器與設(shè)備

MJPS-250型恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9071A鼓風(fēng)干燥箱、DK-S22電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWY2102全溫?fù)u床：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BK1301生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；SBA-40D型生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；YBL10-71103血球計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司；H2S檢測(cè)管：上海豫東電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母發(fā)酵速率的測(cè)定

采用含4種質(zhì)量濃度可同化氮源（N100、N200、N300和N400）的TripleM培養(yǎng)基發(fā)酵。酵母的接種量為5×106CFU/mL，裝液量為300 mL/500 mL，發(fā)酵溫度為20℃，靜置發(fā)酵，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次。發(fā)酵期間每24h稱質(zhì)量，監(jiān)測(cè)CO2質(zhì)量損失，直到連續(xù)兩次質(zhì)量損失不變，發(fā)酵中止。

1.3.2 發(fā)酵過(guò)程中指標(biāo)的測(cè)定

生物量的測(cè)定：每24 h取樣，利用分光光度法測(cè)定樣品在波長(zhǎng)560nm處的吸光度值；H2S產(chǎn)量的測(cè)定[8]：每8 h取樣，利用H2S檢測(cè)管測(cè)定樣品中H2S的產(chǎn)量。

1.3.3 發(fā)酵后指標(biāo)的測(cè)定

揮發(fā)酸含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析，采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析，雙側(cè)檢驗(yàn)計(jì)算線性相關(guān)關(guān)系的顯著性，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

圖1 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母41y5（A）、174y1（B）、182y12（C）生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different yeast assimilable nitrogen concentrations on the growth ofSaccharomyces cerevisiae41y5(A),174y1(B)and 182y12(C)

YAN的質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母41y5、174y1和182y12生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，釀酒酵母41y5、174y1和182y12的生物量均隨初始YAN質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)初始YAN質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，菌株41y5在發(fā)酵初期生長(zhǎng)緩慢，分析原因可能是YAN質(zhì)量濃度過(guò)低，在發(fā)酵初期不能完全滿足菌株41y5的生長(zhǎng)需求；而菌株174y1和182y12在4個(gè)初始YAN質(zhì)量濃度條件下，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生物量均無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，不同菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)YAN含量的需求存在差異。但是，當(dāng)YAN質(zhì)量濃度＞200 mg/L時(shí)，繼續(xù)增加YAN質(zhì)量濃度，對(duì)菌株的生長(zhǎng)速度無(wú)明顯影響，這與TAILLANDIER P等[19]的研究結(jié)果一致。

2.2 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母發(fā)酵速率的影響

CO2釋放速率可以間接反應(yīng)菌株的發(fā)酵速率，YAN的質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母41y5、174y1和182y12發(fā)酵速率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2及表1。由圖2可知，菌株41y5、174y1和182y12的發(fā)酵速率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先快速升高，后緩慢降低直至穩(wěn)定的趨勢(shì)，且發(fā)酵速率在48～144 h內(nèi)達(dá)最高。當(dāng)初始YAN的質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，3株菌株的發(fā)酵周期均最短，與BELTRAN G等[20]的研究結(jié)論一致，即增加初始YAN的質(zhì)量濃度，有助于縮短發(fā)酵周期，加快發(fā)酵速率。當(dāng)初始YAN的質(zhì)量濃度（即300 mg/L和400 mg/L）較高時(shí)，菌株174y1和182y12在48 h左右進(jìn)入快速發(fā)酵階段，比菌株41y5提前48 h。由表1可知，在4個(gè)YAN質(zhì)量濃度條件下，3株菌株的CO2平均釋放速率是不同的。當(dāng)YAN質(zhì)量濃度＞200 mg/L之后，菌株41y5的CO2平均釋放速率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；而對(duì)于菌株174y1和182y12，各自的CO2平均釋放速率在4個(gè)YAN質(zhì)量濃度條件下均具有顯著性差異（P＜0.05），且當(dāng)YAN質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，CO2平均釋放速率降低。

圖2 不可可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母41y5（A）、174y1（B）、182y12（C）CO2釋放速率的影響Fig.2 Effect of different yeast assimilable nitrogen concentrations on CO2release rate ofSaccharomyces cerevisiae41y5(A),174y1(B)and 182y12(C)

表1 不可可同化氮質(zhì)量濃度條件下釀酒酵母41y5、174y1、182y12的CO2釋放情況Table 1 CO2release ofSaccharomyces cerevisiae41y5,174y1 and 182y12 under different yeast assimilable nitrogen concentrations

2.3 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)模擬葡萄酒pH值的影響

YAN的質(zhì)量濃度對(duì)模擬葡萄酒pH值的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)模擬葡萄酒pH值的影響Fig.3 Effect of different yeast assimilable nitrogen concentrations on pH value of simulated wine

由圖3可知，3株菌株發(fā)酵后，模擬酒的pH值均隨初始YAN質(zhì)量濃度的升高而增加，與AKINH等[4]的研究結(jié)果一致，即酒精發(fā)酵后，培養(yǎng)基的pH值與初始YAN質(zhì)量濃度之間存在一定的相關(guān)性。在我國(guó)西北葡萄酒產(chǎn)區(qū)，葡萄酒的pH普遍偏高，而過(guò)高的pH會(huì)對(duì)葡萄酒在陳釀過(guò)程中的顏色和生物學(xué)穩(wěn)定性造成不利影響。因此，若過(guò)多添加氮源，將進(jìn)一步提高葡萄酒的pH值，加劇葡萄酒陳釀過(guò)程中面臨的問(wèn)題。

2.4 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)模擬葡萄酒中揮發(fā)酸含量的影響

揮發(fā)酸含量可以反應(yīng)葡萄衛(wèi)生狀況、葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程及后期管理的狀況。國(guó)標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》中對(duì)葡萄酒揮發(fā)酸含量做了限量要求，葡萄酒的揮發(fā)酸含量應(yīng)≤1.2 g/L，過(guò)高的揮發(fā)酸帶來(lái)的醋酸味會(huì)嚴(yán)重破壞葡萄酒的感官質(zhì)量，降低葡萄酒的品質(zhì)。因此，研究YAN的質(zhì)量濃度對(duì)模擬葡萄酒中揮發(fā)酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，3株菌株發(fā)酵后，模擬酒中的揮發(fā)酸含量隨初始YAN質(zhì)量濃度的升高而增加。其中，菌株174y1的揮發(fā)酸含量明顯高于其余兩株菌，且當(dāng)YAN質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，揮發(fā)酸含量已達(dá)1.14 mg/L。因此，要針對(duì)所使用菌株，合理調(diào)整初始YAN質(zhì)量濃度，避免葡萄酒中揮發(fā)酸含量過(guò)高。2.5可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母產(chǎn)H2S的影響

可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)酵母產(chǎn)H2S的影響見(jiàn)圖5。與目前廣泛使用的商業(yè)菌株UCD522（H2S產(chǎn)量達(dá)705 μL/L）[8]相比，3株菌株在4種初始YAN質(zhì)量濃度下均為低產(chǎn)或不產(chǎn)H2S。當(dāng)YAN質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，3株菌株的H2S產(chǎn)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)于同一株菌，菌株41y5在初始YAN質(zhì)量濃度為400 mg/L條件下，H2S釋放量顯著增高（P＜0.05）；菌株174y1在初始YAN質(zhì)量濃度為200 mg/L和400 mg/L條件下，H2S釋放量顯著增高（P＜0.05），而菌株182y12在初始YAN質(zhì)量濃度為100 mg/L條件下，H2S釋放量顯著增高（P＜0.05），說(shuō)明初始YAN質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)H2S的影響不同，與STURGEON J Q等[12]的研究結(jié)果一致，即發(fā)酵過(guò)程中，H2S的產(chǎn)量由氮源和酵母菌株共同決定。

2.6 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

圖5 可同化氮質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母41y5、174y1、182y12 H2S釋放量的影響Fig.5 Effect of different yeast assimilable nitrogen concentrations on H2S release amount ofSaccharomyces cerevisiae41y5,174y1 and 182y12

選取初始YAN質(zhì)量濃度、最大生物量、CO2平均釋放速率、揮發(fā)酸含量、pH值和H2S釋放量6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，初始YAN質(zhì)量濃度與CO2平均釋放速率、揮發(fā)酸含量、pH值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與最大生物量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與H2S釋放量無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。pH值與H2S釋放量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。GIUDICI P等[10]研究表明，菌株的生長(zhǎng)會(huì)影響H2S的釋放，但是并沒(méi)有研究證明pH值與發(fā)酵過(guò)程中H2S釋放量之間的關(guān)系，僅GIUDICI P等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒裝瓶后，pH越低，H2S含量越低。鑒于H2S的感官閾值極低，以及對(duì)葡萄酒質(zhì)量的損傷的嚴(yán)重性，進(jìn)一步考察pH值與發(fā)酵過(guò)程中H2S釋放量之間的關(guān)系有重要的意義。

表2 3株菌株各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of each index for 3 strains

為考察pH值與酒精發(fā)酵期間H2S釋放量的相關(guān)關(guān)系，本研究同時(shí)測(cè)定了低產(chǎn)H2S釀酒酵母112y4、41y5、182y12和174y1在不同初始pH的Triple M培養(yǎng)基中H2S的釋放量，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，除菌株174y1在3個(gè)pH值下H2S釋放量低于檢出限，其余3株菌株的H2S釋放量均隨pH的升高而增加，說(shuō)明pH值影響H2S釋放量，且兩者呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究以3株低產(chǎn)H2S釀酒酵母41y5、174y1、182y12為研究對(duì)象，研究不同初始可同化氮的質(zhì)量濃度對(duì)3株釀酒酵母的生物量、發(fā)酵速率和H2S釋放量等發(fā)酵特性的影響，并對(duì)不同菌株各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，初始可同化氮的質(zhì)量濃度越高，酵母的生物量越大，發(fā)酵周期越短；發(fā)酵后模擬酒的揮發(fā)酸含量和pH值隨初始YAN質(zhì)量濃度的升高而增加；初始YAN質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)H2S的影響不同。相關(guān)性分析結(jié)果表明，初始YAN質(zhì)量濃度與CO2平均釋放速率、揮發(fā)酸含量、pH值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與最大生物量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與H2S釋放量無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）；在發(fā)酵過(guò)程中H2S的釋放量與發(fā)酵后模擬酒的pH值存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。與釀酒酵母41y5和182y12相比，釀酒酵母174y1在4個(gè)初始可同化氮質(zhì)量濃度下，生物量均最高，發(fā)酵周期均最短，發(fā)酵性能優(yōu)良，盡管其在N200和N400時(shí)，174y1的H2S釋放量均顯著高于其他菌株，但與商業(yè)菌株UCD522相較，其仍屬于低產(chǎn)H2S菌株，因此，釀酒酵母174y1是極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的釀酒酵母。