李 堯 張羽竹 張 利 楊靖鵬 王 菁 樊明濤 魏新元

（西北農林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌712100）

維持體內膽固醇平衡對于身體健康至關重要， 體內膽固醇的平衡源于機體有序而復雜的合成、代謝、吸收和消除[1-2]。 人類的高膽固醇血癥已被證明是引起動脈粥樣硬化， 導致心腦血管疾病的主要原因[3]。 高膽固醇與許多代謝綜合癥相關，包括肥胖、高血脂、高血糖和高血壓等。 為了保證健康，目前，對降低血糖、血清膽固醇和甘油三酯水平的研究頗多[4-5]，藥物防治和控制飲食是最主要的兩種途徑。 然而，使用藥物治療費用大，受到個人經濟制約，而且藥物存在副作用[6]?？刂骑嬍?，低脂、 低膽固醇及低糖食品可以達到一定的降低效果，然而此類食品相對很少，也存在價格偏高的問題，難以長期維持，而且其功效性也會隨著時間逐漸降低[7]。 新的飲食方法便漸漸產生，包括在食品中添加或增加可溶性纖維[8]、大豆蛋白[9]、植物固醇類[10]、益生菌和益生元[11]等。

益生菌是對宿主有益的一定數量的微生物[12-13]。近年來益生菌的研究和應用越來越多[14-16]。乳酸菌（lactic acid bacteria）普遍被認為是安全的益生菌，人體和動物體的腸道內大量存在。研究表明足夠數量的乳酸菌具有降低血清膽固醇水平的效果，既能平衡體內合成的膽固醇量，也能降低食源性膽固醇量[17]。 將具有降膽固醇性能的乳酸菌應用于飲食是一種不錯的選擇， 乳酸菌不僅能起到降低膽固醇的功效， 而且還有維持腸道微生態(tài)平衡的作用[18]。 影響乳酸菌降膽固醇的因素很多，包括溫度，菌株數量和種類，pH，時間，益生元等[19-20]。目前， 關于益生菌降膽固醇的機制主要通過益生菌細胞同化作用，細胞壁的吸附，共沉淀，共沉淀與同化的結合作用[21-22]，并最終隨著益生菌排出體外，從而降低腸道環(huán)境中膽固醇存在量，減少人和動物對飲食攝入的膽固醇的吸收[14]。

本研究采用操作相對簡單的硫酸鐵銨測定膽固醇含量法。 從本實驗室分離自傳統(tǒng)食品的大量乳酸菌菌株中篩選降膽固醇效果較好者， 然后利用更精確的測定膽固醇含量的鄰苯二甲醛法，確定乳酸菌菌株的降解膽固醇活性， 分析這些優(yōu)良菌株的耐膽鹽特性、生長特性、產酸特性，研究了降膽固醇的能力與不同生長時期的關系， 評估這些菌株的耐酸特性及在模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 融合魏斯氏菌（Weissella confusa），4 株，分別編號WS1～WS4；短乳桿菌（Lactobacillus brevis），4 株，分別編號LB1～LB4；食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），5 株，分別編號CW1～CW5；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），17 株，分別編號LP1～LP17，共30 株乳酸菌菌株，均分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS （Man Rogosa and Sharp Medium， MRS）培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母浸粉4 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，自然pH，121 ℃高壓滅菌15 min。

改良MRS：MRS 培養(yǎng)基中加入1%的碳酸鈣，混勻。

MRS-CHOL（膽固醇MRS 培養(yǎng)基）：MRS 培養(yǎng)基中， 含0.2%巰基乙酸鈉，0.2%膽鹽，100 μg/mL的膽固醇。

1.1.3 主要試劑 膽固醇（≥95%），分析純，購自Sigma-Aldrich；鄰苯二甲醛，分析純，購自Solarbio；胃蛋白酶，優(yōu)級純，購自Solarbio。

膽固醇儲存液，50 mg 膽固醇溶于無水乙醇中，定容至50 mL，質量濃度1 mg/mL。

硫酸鐵銨顯色劑： 溶解4.463 g 硫酸鐵銨于100 mL 85%的磷酸中，即為儲備液。 吸取該儲備液10 mL，用濃硫酸定容至100 mL，即為顯色劑[23]。

鄰苯二甲醛顯色劑（現用現配）：50 mg 鄰苯二甲醛溶于100 mL 冰乙酸即可[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌活化、 復壯與馴化 取冷凍保藏的乳酸菌菌種菌液100 μL 加入5 mL MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)取培養(yǎng)液在改良MRS 平板上進行劃線分離，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，從平板上挑取菌落大，溶鈣圈明顯的單菌落繼續(xù)在改良MRS 平板上劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h，按照此方法連續(xù)劃線分離3 次， 最終獲得的溶鈣圈明顯的大單菌落轉接到斜面上培養(yǎng)后保藏備用[24]。

按照上述活化復壯的方法將菌株接種于含有0.1%膽鹽的MRS 培養(yǎng)基進行馴化并轉接到斜面上培養(yǎng)后保藏備用。

1.2.2 膽固醇標準曲線的繪制

1.2.2.1 硫酸鐵銨法 取質量濃度為1 mg/mL 的膽固醇儲存液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 分別加入10 mL 干凈試管中， 依次加入無水乙醇1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5 mL，最后依次緩慢加入2 mL 配好的硫酸鐵銨試劑， 混勻， 待管冷卻至室溫后，560 nm 波長下比色[24]。 以膽固醇濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，作標準曲線。

1.2.2.2 鄰苯二甲醛法 取質量濃度為1 mg/mL的膽固醇儲存液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 分別于10 mL 干凈試管中，60 ℃水浴， 待乙醇揮發(fā)干凈，加2 mL 現配的鄰苯二甲醛顯色劑，振蕩均勻后，室溫靜置10 min，將1 mL 濃硫酸緩慢加入，混勻，靜置20 min，560 nm 波長下比色[12]。 以膽固醇濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，作標準曲線。

1.2.3 降膽固醇乳酸菌的初篩 根據對硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法的比較， 在分析本實驗室分離的30 株乳酸菌的降膽固醇能力，初步篩選優(yōu)良的降膽固醇乳酸菌菌株試驗中， 本研究選擇采用操作較為簡單快捷的硫酸鐵銨法測定膽固醇含量。

將活化的對數生長后期的乳酸菌等量分別接種等體積的含膽固醇的MRS 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)到穩(wěn)定期，培養(yǎng)液濁度大致相同。將乳酸菌培養(yǎng)液離心（5 000 g，10 min）的上清液2 mL 至干凈試管中，加無水乙醇至10 mL，充分搖勻，4 500 g離心10 min， 取上清液1 mL 至新的干凈試管，再加入2 mL 硫酸鐵銨顯色液，充分混合，待冷卻后于560 nm 處測定吸光值[24-25]。 以未接種乳酸菌的膽固醇MRS 培養(yǎng)基為對照測定其中的膽固醇總量。上清中檢測出來的膽固醇含量越低，說明膽固醇降低效率越大，乳酸菌降膽固醇的能力越強。

膽固醇降低率=A-B/A×100%

其中：A——未接種乳酸菌的膽固醇MRS 培養(yǎng)基中膽固醇含量；B——試驗菌株發(fā)酵后上清液中膽固醇含量。

1.2.4 膽鹽耐受性能分析 通過分析乳酸菌在含膽鹽的培養(yǎng)基中的生長情況來判斷其膽鹽耐受性能。在液體MRS 培養(yǎng)基中加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W/V）的膽鹽，以不含膽鹽的MRS 培養(yǎng)基作為對照[26-27]?；罨瘮U大培養(yǎng)后的優(yōu)選乳酸菌菌株按2%（V/V）的接種量加入到含不同膽鹽濃度的MRS 培養(yǎng)基中， 每個試驗3 次重復，37 ℃培養(yǎng)24 h 后搖勻， 測定不同菌株在不同濃度膽鹽里生長的渾濁度（吸光度OD600）來分析其耐受水平。

膽鹽耐受力（%）=含膽鹽的培養(yǎng)基的OD 值/空白培養(yǎng)基的OD 值×100%

1.2.5 初篩降膽固醇能力較強菌株的降膽固醇效力分析 膽固醇降低效力表示單位菌體量對膽固醇的降低量。 乳酸菌降膽固醇效力的分析采用鄰苯二甲醛法Ying Huang1[28]。將優(yōu)選菌株活化擴大培養(yǎng)后，按照2%（V/V）的接種量分別接種于等體積的含或者不含0.2%膽鹽的MRS-CHOL 培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)20 h，測定培養(yǎng)物在600 nm 的吸光度值，并以此樣品5 000 g，離心10 min 收集上清液； 接著取1 mL 上清液加入干潔的試管中，再加入2 mL 33%的KOH，3 mL 的無水乙醇，充分搖勻后37 ℃水浴加熱15 min 后，冷卻至25 ℃；再向管中加5 mL 正己烷，1 mL 無菌水， 漩渦振蕩2 min，待相分離后，取3 mL 正己烷層（上層）放入干凈玻璃試管，氮吹儀干燥后，向試管加入4 mL 的鄰苯二甲醛顯色液 （現配現用）， 室溫靜置10 min， 緩慢注入濃硫酸2 mL， 充分混合并靜置20 min 后于560 nm 處測定吸光值[20，28-29]，每個處理3次重復。 吸光值越高，說明其中含膽固醇量越大。分別以未接種乳酸菌的含或不含膽鹽的MRSCHOL 培養(yǎng)基為對照測定其中的膽固醇總量。 未接菌的MRS-CHOL 中的膽固醇的量減去各菌株對應上清液中膽固醇的量， 即為菌體降低膽固醇的量[30]，然后以此除以乳酸菌的生長量，即可得乳酸菌的膽固醇降低效力。 計算公式如下：

膽固醇降低效力（μg/u）=膽固醇降低量（μg）/乳酸菌生長量（u）

乳酸菌生長量（u）定義為測定乳酸菌降低效力的培養(yǎng)液的1 單位濁度值（即1 OD600）表示。

1.2.6 生長曲線和產酸曲線的測定 將優(yōu)良菌株活化擴大培養(yǎng)后， 以2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中， 于37 ℃靜置培養(yǎng)， 每隔2 h 定時取樣，用測定發(fā)酵液在600 nm 處吸光值，3 次重復，然后繪制生長曲線和產酸曲線。

1.2.7 接種不同生長階段乳酸菌對降膽固醇的影響 將優(yōu)良菌株活化擴大培養(yǎng)后，按照2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)，分別取菌株生長10 h 和20 h 時得培養(yǎng)液按2%體積比接種于MRS-CHOL 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，按照1.2.5 節(jié)測定優(yōu)選菌株發(fā)酵液中膽固醇含量，重復3 次。

1.2.8 耐酸性能 調節(jié)MRS 培養(yǎng)液pH 值來分析乳酸菌的耐酸能力。用0.1 N 的HCl 調節(jié)MRS 培養(yǎng)液的pH 分別為2.5，3.5，4.5，以自然pH 的MRS培養(yǎng)液作為對照[31]。優(yōu)選菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD600為1 左右后按2%（體積分數）接種量接種于不同pH 的MRS 培養(yǎng)液中，分別測定培養(yǎng)0，2，4，6 h 時培養(yǎng)液中乳酸菌的細胞濃度。 存活細胞數按照稀釋平板計數法， 涂布于固體MRS 平板上，37 ℃培養(yǎng)24 ～48 h， 計算菌落形成單位CFU（Colony Forming Unit），3 次重復[32]。

1.2.9 乳酸菌耐受模擬胃腸道環(huán)境測試 乳酸菌對人工胃液[33]的耐受性參考Soundharrajan Ilavenil[34]。 人工胃液是將過濾除菌的胃蛋白酶（終質量濃度為3 g/L）溶解在滅菌的0.5% NaCl 溶液中，并用0.1 mol/L 的HCl 調節(jié)pH 到2.0，2.5 和3.0[35]?；罨膬?yōu)選菌株按2%接種量轉接5 mL 新鮮的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600約1.0。6 000 g 離心15 min 收集菌體， 用0.1%的蛋白胨水清洗一次，加入5 mL 人工胃液，重懸菌體后37℃靜置培養(yǎng)，按照稀釋平板計數法（同1.2.8 節(jié)）分別測定0，1，2，3，4 h 時培養(yǎng)物中的存活細胞數，重復3 次。

1.2.10 數據分析 用Excel，SPSS 等軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法測定膽固醇方法的比較及膽固醇標準曲線的繪制

通過硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法對膽固醇含量進行測定，并繪制了標準曲線（數據未提供）。在一定的檢測范圍內， 兩種方法的檢測OD 值與膽固醇含量之間都顯示了良好的線性關系。 硫酸鐵銨法的標準曲線為y=0.5476x+0.0167， 決定系數為0.9789。 采用此法測得培養(yǎng)基中膽固醇的添加回收率為92.67%；鄰苯二甲醛法所獲得標準曲線為y=1.2823x+0.0048，決定系數為0.9982，此法測得培養(yǎng)基中膽固醇的添加回收率可達到99.92%。比較兩種測定方法， 硫酸鐵銨法較鄰苯二甲醛法穩(wěn)定性和精確度略低，但其操作相對簡單，沒有危險性，便于用來測定大批量數據，因此在初篩優(yōu)良菌株時采用此法。而鄰苯二甲醛法穩(wěn)定性更好，精確度更高， 但該方法不足之處在于試驗中要進行皂化、提取、真空抽干后才能進行顯色，操作繁瑣，耗時長，而且其中用到了濃硫酸，具有一定的危險性，不適于大批量樣本的測定，因此在菌株初篩之后，需要更為精準數據分析時采用。

2.2 降膽固醇乳酸菌的篩選

硫酸鐵法被用于從對30 株（其中融合魏斯氏菌（Weissella confusa），4 株，分別編號WS1～WS4；短乳桿菌 （Lactobacillus brevis），4 株， 分別編號LB1～LB4；食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），5 株，分別編號CW1～CW5； 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），17 株，分別編號LP1～LP17）從自然發(fā)酵食品中分離的乳酸菌中篩選具有降膽固醇能力菌株的篩選，各菌株的將膽固醇效果如表1。

從表1 可以看出， 不同的菌株降膽固醇的能力不同，即使是同種的不同菌株之間也存在差異。其中6 株菌的膽固醇降低率大于20%， 它們分別是WS1、LP2、LP3、LP4、LP5 和LP6，其降膽固醇效率分別達到34.06%，34.85%，30.61%，21.03%，28.73%和37.15%，6 株菌膽固醇降低率依次為LP6＞LP2＞WS1＞LP3＞LP5＞LP4，此6 株菌被選取進行進一步的其他性能和功能的分析和評價。

表1 30 菌株乳酸菌降膽固醇能力的分析Table 1 The analysis of cholesterol-lowering ability of 30 lactic acid bacteria

2.3 6 株降膽固醇能力較強菌株的耐膽鹽能力分析

人體腸道膽鹽濃度大概在0.03%～0.3%之間，當乳酸菌隨食物進入胃腸道后會面臨膽鹽的作用，為此，本研究對篩選出來的降膽固醇效果較好菌株進行了耐膽鹽分析，如表2。

表2 6 株乳酸菌菌株的耐膽鹽性能分析Table 2 The analysis of bile salt resistance of the 6 lactic acid bacteria

從表2 可以看出6 株乳酸菌對不同的膽鹽濃度，表現出不同的耐受性，膽鹽濃度越高，耐受性越差， 不同的菌株對相同的膽鹽濃度， 也呈現差異。在0.1%的膽鹽濃度下，6 株菌生長性能都還可以， 其中WS1 最好， 耐受力為85.56%， 其次是LP6，耐受力為56.65%，而其他4 株菌耐受力依次為LP4 36.65%；LP2 32.77%；LP5 32.47%；LP3 32.01%。 當膽鹽濃度達到0.2%和0.3%時，24h 后各菌株依然能夠存活。隨著膽鹽濃度升高，菌株生長情況越來越差， 表明其收到膽鹽的抑制越來越明顯。 試驗結果表明，菌株均能適應0.2%和0.3%膽鹽濃度的環(huán)境，24 h 后菌株仍有存活，結合人體腸道內的膽鹽水平，0.2%的膽鹽濃度被用于后期的降膽固醇能力及其他特性檢測中。

2.4 6 株乳酸菌在含或不含膽鹽情況下降膽固醇效率和效力的分析

為了進一步分析體內膽鹽對乳酸菌降膽固醇的影響， 根據普遍模擬的腸道內0.2%的膽鹽濃度，本研究對6 株乳酸菌在含0.2%和不含膽鹽的膽固醇MRS 培養(yǎng)基中降膽固醇的效率和效力進行了分析，結果如圖1 所示。

圖1 6 株乳酸菌在含0.2%和不含膽鹽培養(yǎng)基中的降膽固醇能力分析Fig.1 Analysis of cholesterol-lowering of 6 strains with or without 0.2% bile salt

結果顯示，在含0.2%膽鹽的培養(yǎng)基中，各菌株降膽固醇的效率和效力都明顯高于不含膽鹽的培養(yǎng)基。不同菌株的降膽固醇效率不同，在不含膽固醇的培養(yǎng)基中， 降膽固醇效率從高到低依次為LP6、LP2、WS1、LP3、LP5 和LP4；而在含膽鹽的培養(yǎng)基中， 降膽固醇效率從高到低依次為LP6、WS1、LP2、LP3、LP5 和LP4。 不同菌株的降膽固醇效力也具有差異，在不含膽固醇的培養(yǎng)基中，降膽固醇效力從高到低依次為WS1、LP2、LP5、LP6、LP3 和LP4；而在含膽鹽的培養(yǎng)基中，降膽固醇效力從高到低依次為WS1、LP6、LP2、LP3、LP4 和LP5。 在含膽鹽的培養(yǎng)基中，菌株降膽固醇效力的提升效果高于降膽固醇效率的提升效果， 間接反映了0.2%的膽鹽一方面對試驗乳酸菌株具有一定的抑制作用， 另一方面膽鹽還可以促進乳酸菌的降膽固醇能力。

將乳酸菌在含0.2%膽鹽的培養(yǎng)基中的降膽固醇效率和效力進行綜合分析，結果如圖2。

圖2 0.2%膽鹽條件下6 株菌的降膽固醇效率和效力分析Fig.2 Efficiency and efficacy analysis of the 6 strains lowering cholesterol

由圖2 可以看出，在含0.2%的膽鹽的培養(yǎng)基中，無論是膽固醇降低效率還是膽固醇降低效力，WS1、LP6、LP2 和LP3 都比LP4 和LP5 要高，因此，本論文選擇WS1、LP6、LP2 和LP3 這4 株菌進一步進行其他生長特性和生理功能的分析。

2.5 復篩的4 株優(yōu)良乳酸菌菌株生長曲線和產酸曲線的測定

為了進一步分析4 株復篩的優(yōu)良乳酸菌的生長特性和生理功能， 本論文對它們的生長曲線和產酸曲線進行了分析，如圖3 所示。

圖3 4 菌乳酸菌菌株的生長曲線和產酸曲線Fig.3 Growth curves and acid-producing curves of 4 strains lactic acid bacteria

從圖3 可以看出，4 株優(yōu)良菌株WS1，LP2，LP3，LP6 的生長曲線基本相似，4 h 乳酸菌進入對數生長期，同時大量產酸，pH 值有較大幅度降低，到18 h 之后開始進入穩(wěn)定期，此后的生長曲線和pH 值曲線皆趨于平緩，直到24 h 左右。 這不僅為后面菌株耐酸性的研究中pH 的設置提供了依據， 也為后期分析不同的母種選擇時間對降膽固醇的影響提供了參考。

2.6 種子液的選取時機對降膽固醇的影響

為了分析從種子液中選取母種轉接時機對菌株降膽固醇能力的影響， 本研究分別選取了發(fā)酵液生長到10 h（對數期）和20 h 時（穩(wěn)定期）的培養(yǎng)物作為種子轉接到膽固醇MRS 培養(yǎng)液中，然后測定培養(yǎng)24 h 時菌株的降膽固醇效果，如圖4。

優(yōu)選菌株在不同生長階段轉接的母種， 經過相同時間的培養(yǎng)后，由圖4 可以看出，它們對膽固醇的降低效率和降低效力各有不同。 但無論是降低效率還是降低效力， 轉接來自4 株菌對數期的種子液（10 h）均比來自穩(wěn)定期的種子液（24 h）的要高， 而且對數生長期的種子液表現的降低效力明顯高于穩(wěn)定期的種子液所對應的降低效力，而兩者之間的膽固醇降低效率差別并不明顯， 盡管對數期的膽固醇降低率略高于非對數期。

圖4 不同生長期的種子液對菌株降膽固醇能力Fig.4 Cholesterol-lowering abilities of seed solution from different growth stage of the 4 strains

2.7 4 株優(yōu)良菌株的耐酸特性

本研究對復篩后的4 株優(yōu)良菌株在不同pH條件下（自然pH、pH 2.5、pH 3.5 和pH 4.5）的存活力進行了分析， 菌株存活力通過測定0，2，4 和6 h 時的CFU/mL 來顯示，如圖5。

圖5 4 株菌在不同pH 值下的存活力Fig.5 The viability of the 4 strains under different pH

4 株復篩菌株在不同pH 的培養(yǎng)基中，在不同的培養(yǎng)時段，其存活力不同。 pH 2.5 時，培養(yǎng)到2 h 時，4 株菌的存活力降低速度非?？欤?幾乎降低105倍，2 h 后略微平緩，但是到4 h 時，菌數降為0，所取培養(yǎng)液無菌落形成。 pH 3.5 時，培養(yǎng)到2 h時，4 株菌的降低速度都較pH 2.5 的速度慢，大概降低103～104倍，隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)液中活細胞數繼續(xù)減少，到6 h 時，各菌株檢測不到活菌。 而對于pH 4.5 和自然pH 條件下，菌體在2 h時，菌株存活力略有降低，到4 h 和6 h 時，菌株存活力又開始慢慢上升，但pH 4.5 的總是低于自然pH 的存活力。 結果說明，pH 低于3.5 時，4 株菌的生長會受到較為強烈的抑制。 而高于4.5 時，菌株可以較好地存活。

2.8 4 株復篩菌株在模擬胃腸道的存活率分析

人體胃部的pH 一般為2.7 左右，腸道為5.5，而食物在胃里滯留時間為3 h 左右。 因此，如果菌株能夠順利通過胃部進入腸道， 它們將會比較容易存活并發(fā)揮益生菌的功能。在此，本研究進一步對菌株在模擬胃腸道環(huán)境（人工胃酸）下，在不同時間的存活力進行了分析， 對人工胃酸作用的分析分別設定了pH 2、pH 2.5 和pH 3 下在0，1，2，3 和4 h 時的處理條件，如圖6。

圖6 顯示， 在3 種pH 條件下，4 株菌的數量都在減少，pH 越低， 降低速度越快， 對于1 010 CFU/mL 左右的初接種量，在4 h 時，各菌株依然有102～108的細胞存活。 pH 3 條件下的存活力高于pH 2.5 的，pH 2.5 的又高于pH 2 的，高pH 值條件下，4 菌株存活率明顯增強。 試驗結果表明，4菌株在人工胃酸中， 在3～4 h 均具有一定的耐受性。

圖6 4 菌株在人工胃酸中的存活力Fig.6 The survival of 4 strains in simulated gastric acid

3 結論

大量的研究發(fā)現， 許多乳酸菌具有降膽固醇功能，包括羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌及長雙歧桿菌等[36]。在本研究中，4 種菌的30 個菌株被用于檢測其降膽固醇能力，結果顯示， 不同的菌種， 甚至同一菌種的不同菌株之間，其降膽固醇效率及效力存在差異，這可能與菌株本身的特性有關，具體的原因尚不清楚，有待進一步研究。本研究中最終篩選出了2 種菌，融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）中4 個菌株具有良好的降膽固醇功能，其中融合魏斯氏菌為首次報道。

本研究中， 測定膽固醇含量分別采用硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法，通過數據分析來看，盡管鄰苯二甲醛法所測得數據偏小， 但是大體的趨勢和硫酸鐵銨法所得數據在趨勢上保持一致，因此，在待測樣品較多，或者需要耗時縮短時，可以采用硫酸鐵銨法，如果需要更為精確和準確的數據，還是建議采用鄰苯二甲醛法。

當培養(yǎng)基中含有膽鹽時， 乳酸菌的存活力下降，0.1%的膽鹽情況下， 乳酸菌的耐受性尚可，但是當膽鹽濃度高于0.2%時，乳酸菌的耐受性急劇降低。 在0.2%膽鹽存在情況下，盡管存活力下降了， 但是其降膽固醇效率和效力都提高了， 如圖1，這說明膽鹽對乳酸菌降膽固醇具有促進作用。4株優(yōu)選乳酸菌的生長特性和產酸特性顯示它們穩(wěn)定性很好，耐酸性的分析表明，當pH 4.5 時，菌株的穩(wěn)定性和常規(guī)pH 時的一致， 隨著pH 值降低，它們的耐受性越來越差。 對耐人工胃酸的結果表明，乳酸菌在其中的耐受性似乎要強于在調節(jié)pH的培養(yǎng)基中的耐受性。盡管如此，但是乳酸菌在人工胃酸中的存活力下降還是比較明顯。因此，如何保證乳酸菌能順利地通過胃部已經成為當前研究的熱點。

降膽固醇乳酸菌若要用于人體健康的維護，其必須具有良好的耐酸，耐膽鹽特征，這樣才能保證它們順利通過胃和十二指腸， 以一定的有效數量進入到腸道中， 為人體提供有效的健康支撐作用。 當前人們已經在添加益生元[37]、適當介質或者選擇合適的包被材料[38]、載體材料來提高乳酸菌的存活力方面進行了大量的研究[39]，研究的成果也被逐漸用于生產實踐中。

本研究表明， 所篩選的4 株乳酸菌在體外具有膽固醇降低能力，并具有一定的耐酸性、耐膽鹽特性，這為今后的應用準備了合適的應用菌株，也為研究乳酸菌降膽固醇機制打下了基礎并準備了研究材料。