賀寶玉 馮丁丁 蔣 迪 白 穎 董秀芳 啟 航*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034）

海參營養(yǎng)價值極高， 具有許多生理和藥理活性，2017年我國的海參產(chǎn)量達(dá)到22 萬t[1]。 海參的嫩度是產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一， 影響海參加工的品質(zhì)。海參在加工過程中存在質(zhì)地變硬，或軟爛的問題，且容易發(fā)生自溶，尤其是受到外部刺激如紫外線刺激等[2-3]。前期的研究發(fā)現(xiàn)氧化物質(zhì)、內(nèi)源酶的作用對肉品的硬度、口感、風(fēng)味、營養(yǎng)價值產(chǎn)生較大的影響， 特別是活性氧 （Reactive Oxygen species，ROS）具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損壞[4]，也會引起海參發(fā)生氧化損傷[5-6]。脂質(zhì)過氧化不僅發(fā)生在生物體中，在食品加工及貯藏過程中也常常伴隨發(fā)生， 從而影響食品的品質(zhì)[7]。 蛋白降解會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的氧化會對肌肉組織造成不良的影響。研究發(fā)現(xiàn)意大利白豬肉品質(zhì)與cathepsin L 和cathepsin S 相關(guān)聯(lián)，這兩種內(nèi)源酶會對肉的嫩度、彈性產(chǎn)生影響[8]。組織蛋白酶L 和鈣蛋白酶在該嫩化過程中起較重要作用， 在肌肉嫩化中的作用已被廣泛證明[9]。 低溫處理能引起體內(nèi)ROS 的生成、內(nèi)源酶活力的提高、脂質(zhì)的氧化，這些都成為影響低溫嫩化產(chǎn)品品質(zhì)的因素。然而，關(guān)于海參品質(zhì)與內(nèi)源酶、 蛋白質(zhì)降解、 自由基生成的研究鮮見報道。本文圍繞品質(zhì)與理化性質(zhì)變化研究，以期為海參低溫加工獲得良好品質(zhì)產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 鮮活海參，購自大連市劉家橋市場，平均長度（17.5±2.5）cm。

1.1.2 主要試劑 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）和苯甲基磺酰氟（PMSF），購自Sigma；四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚丙烯酰胺（Acry）、過硫酸銨（APS）、二硫蘇糖醇（DTT），購自上海生工生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器、設(shè)備

ATTO 垂直電泳槽 （AE-6500），ATTO；ATTO電泳儀電源（AE-8135），ATTO；凝膠成像儀（MFChemiBIS 2.0），KOOLANCE；F-2700 型熒光分光光度計，日立高新技術(shù)公司；M20 型酶標(biāo)定量測定儀， 瑞士Tecan Infinite 公司；ZKBTES-55 型真空冷凍干燥機，Virtis USA；A200 型； 電子自旋共振波譜儀（ESR），德國BRUKER 公司；數(shù)顯勻漿機（T25），德國IKA 集團(tuán)。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理 將鮮活海參宰殺去臟、去筋，切割后每3～5 塊分裝于玻璃皿中置于20 ℃恒溫箱中分別放置1/24，1/4，1/2，1，2，3，4，5，6 d，沒有經(jīng)過任何處理的新鮮海參作為對照 （0 d），-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 L-羥脯氨酸含量測定 稱取不同處理時間的海參各10 g，加入10 mL 蒸餾水，放于80 ℃水浴鍋中水浴2 h（隔30 min 搖勻1 次），于1 500 xg離心30 min，取上清液過濾，取0.5mL 濾液加至水解管中，再加入3 mL 3.5 mol/L 的硫酸，于105 ℃烘箱中水解16 h，取出冷卻至室溫，加水稀釋至5 mL，取1 mL 上述稀釋液過濾再加入1 mL 3 mol/L的NaOH ，混勻后取0.5 mL 上述溶液置于1.5 mL EP 管中，加入0.25 mL 氧化液，混勻。室溫放置20 min 后，加入0.25 mL 顯色液，混勻后用錫紙包好置于60 ℃中放置15 min，再用流水冷卻3 min，取200 μL 用酶標(biāo)儀測定在558 nm 下的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（y = 0.0721x + 0.0591，R2= 0.999）求含量。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)測定 不同處理時間的海參各取3～5塊（約1.5 cm × 1.5 cm）進(jìn)行TPA（Texture Profile Analysis）分析。 樣品置于測試平臺上，于室溫下進(jìn)行測定。TPA 測試探頭為P/50。測試條件如下：測前速率、測試速率與測后速率均為 1 mm/s；壓縮程度70%；停留間隔5 s；觸發(fā)值5 g。

1.3.4 SDS-PAGE 不同處理時間的海參體壁組織與裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA -2Na，10 mmol/L DTT，1% Triton X-100，0.1% SDS）1∶3 比例混合，冰浴中研磨提取全蛋白；然后4 ℃，12 000xg 條件下離心15 min。 根據(jù)樣品的蛋白濃度用SDSPAGE 的5×上樣緩沖液 （含0.25 mol/L pH 7.5 Tris-HCl，8 mol/L 尿素，5% SDS，5% β-巰基乙醇）按一定比例稀釋，沸水浴煮5 min，冷卻后離心。使用5%濃縮膠和10%分離膠跑電泳。 電泳結(jié)束后將凝膠取出，切膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染液染色過夜。 脫色液脫色約1 h，倒入一半脫色液一半水脫色1 h，最后用凝膠成像儀的可見光成像系統(tǒng)成像。

1.3.5 組織蛋白酶L（CL）活力的測定 不同處理時間的海參體壁組織與提取液 （含有50 mmol/L pH 7.0 的磷酸鹽緩沖溶液、0.1% Triton X-100 和1 mmol/L EDTA）按照1∶3（m∶v）的比例混合，冰浴研磨提取， 再于4 ℃，10 000 r/min 的條件下離心10 min，取上清液即為所需要的粗酶提酶液。

取待測樣液50 μL， 加入25 μL 反應(yīng)緩沖液（含60 mmol/L 乙酸、340 mmol/L 乙酸鈉、4 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、8 mmol/L DTT）和25 μL 20 μmol/L 底物（Z-Phe-Arg-Mec），混勻后37 ℃水浴15 min；設(shè)置空白對照組，取待測樣液50 μL，加入100 μL 終止液（含0.1 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.1 mol/L 氯乙酸）和25 μL 20 μmol/L 底物，同樣混勻后37 ℃水浴15 min； 最后樣品組加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，空白對照組加入25 μL 反應(yīng)緩沖液，采用熒光分光光度計測定酶活力，激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為460 nm。 以每毫克蛋白熒光值的差值比較組間CL 活力的變化。

1.3.6 Caspase-3 活力的測定 不同處理時間的海參體壁組織與裂解液 （含25 mmol/L pH 7.4 HEPES，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT，1 μmol/L 胃蛋白酶抑制劑，1 mmol/L PMSF）1∶3 比例混合， 冰浴中研磨提取， 并在4 ℃、10 000 r/min 的條件下離心10 min，取得的上清液即為所需要的酶液。 在酶標(biāo)板中加入10 μL 的待測酶液、80 μL 分析液 （含20 mmol/L pH 7.4 HEPES，1% CHAPS，50 mmol/L DTT 和5 mmol/L EDTA）和10 μL 底物（Ac-DEVD-PNA），設(shè)置3 個平行試驗，并設(shè)置對照組加入90 μL 分析液和10 μL 樣液， 然后測定405 nm處37 ℃條件下分別反應(yīng)0 min 和30 min 的吸光值。

1.3.7 自由基測定 將低溫處理后的海參直接凍干，制備凍干粉，然后將其填入石英樣品管中，保證每個樣品的填充量一致。 通過ESR 檢測自由基生成情況， 具體檢測條件如下： 微波功率6.10 mW，中心磁場3.460 G，轉(zhuǎn)換時間480 msec，掃描寬度200 G，調(diào)制幅度1G，調(diào)制頻率100 kHz，時間常數(shù)5 242.88 msec。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)以3 個平行組數(shù)據(jù)的平均值表示，并且計算標(biāo)準(zhǔn)差；用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與討論

以海參、海參體壁為原料，其在20 ℃低溫條件下處理不同時間：0，1/24，1/4，1/2，1，2，3，4，5，6 d，所產(chǎn)生品質(zhì)和理化性質(zhì)變化的結(jié)果如圖1～圖8所示。

2.1 低溫處理條件下海參的形態(tài)變化

從圖1 可以看出， 低溫處理初期海參體型上有所增大，在處理1 d 時海參體壁開始鼓泡，組織開始拉伸并逐漸癱軟，表皮開始分解，隨著在20℃低溫條件下處理時間的延長， 海參的形態(tài)變化更加明顯，開始軟爛、變黏，直到完全失去其原有形態(tài)。

圖1 海參在20 ℃處理條件下形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.2 低溫處理條件下海參的膠原溶出情況

從圖2 可以看出， 在低溫條件下隨著處理時間的延長，海參的可溶性膠原含量不斷上升，在低溫處理初期， 其上升趨勢較為緩慢， 與對照組相比，升高不顯著。從1/2 d 開始，其可溶性膠原含量呈顯著上升趨勢， 處理至6 d 時其可溶性膠原含量為對照組含量的3.23 倍。 該結(jié)果與2011年，Zhu 等人[10]發(fā)現(xiàn)的隨著處理時間的延長鮑魚肌肉的可溶性膠原含量呈上升趨勢一致， 也與2015年，Starkey 等[11]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果：隨著羊羔老化時間的延長， 可溶性膠原含量呈增加的趨勢相符。 2016年，王鳳林等[12]研究發(fā)現(xiàn)在熱處理過程中，隨處理時間的延長和溫度的升高， 海參體壁與羅非魚皮膠原逐漸發(fā)生降解，海參體壁最終完全降解，而羅非魚相對較穩(wěn)定。

圖2 海參在20 ℃處理條件下膠原溶出情況Fig.2 Collagen dissolution of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.3 低溫處理條件下海參的質(zhì)構(gòu)變化

由圖3 所示，隨著低溫處理時間的延長，海參的硬度和咀嚼度呈現(xiàn)出了一個先增大后減小的趨勢。 海參硬度在1/4d 時達(dá)到最大值33 822.9 g±619g（P<0.05），隨后隨著處理時間的延長，海參硬度變化劇烈，呈顯著下降趨勢，在1～2 d 這段期間下降最為嚴(yán)重， 最終其硬度下降為0 d 時硬度的0.92%；在1/4 d 時海參咀嚼度達(dá)到最大值11 396.7 g±1 761 g（P<0.05），隨著時間的延長，海參咀嚼度開始下降，而且在這個過程中，從1 d 開始其變化顯著， 下降劇烈， 在1～2 d 這段期間下降最為嚴(yán)重， 在6 d 時其咀嚼度降為0 d 咀嚼度的0.22%。2016年，鄭美靜等[13]發(fā)現(xiàn)在超高壓條件下海參的硬度和咀嚼度呈現(xiàn)相關(guān)性結(jié)果一致。 海參硬度與咀嚼度的下降可能與可溶性膠原含量有關(guān)。

圖3 海參在20 ℃處理條件下質(zhì)構(gòu)變化Fig.3 Texture changes of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.4 低溫處理條件下海參的蛋白降解情況

圖4 海參在20 ℃處理條件下蛋白質(zhì)降解情況Fig.4 Protein degradation of sea cucumber at 20 ℃treatment condition

從圖4 可以清楚的看出200.0ku （高分子質(zhì)量，HMW）和44.3 ku（肌動蛋白，actin）的兩條蛋白條帶。肌動蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，它具有多種結(jié)合位點，能夠和不同的蛋白質(zhì)結(jié)合，完成多種細(xì)胞功能。 在高分子質(zhì)量條帶中，從1 d 開始，高分子開始降解，直到3 d 開始降解加劇。 而在肌動蛋白條帶中，蛋白從1 d 時開始降解，直到3 d 時，肌動蛋白條帶完全消失，說明在低溫處理3d 后海參的結(jié)構(gòu)幾乎完全喪失， 從圖1 海參的形態(tài)變化中也可看出。 這與2011年Christensen 等[14]發(fā)現(xiàn)鯡魚和2012年Thavaroj 等[15]研究發(fā)現(xiàn)的鯰魚和羅非魚經(jīng)長時間低溫處理后其肌動蛋白會發(fā)生降解的結(jié)果相符。因此可以說明，海參長時間低溫處理可能會引起蛋白降解。 2003年，Ladrat 等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：隨著鱸魚存儲時間的延長， 蛋白質(zhì)的降解可能與組織蛋白酶L 的激活有關(guān)。

2.5 低溫處理條件下海參的內(nèi)源酶變化

海參低溫處理初期組織蛋白酶-L 活力維持在較穩(wěn)定的水平（圖5a），隨著低溫處理時間的延長，1/4 d 時，組織蛋白酶-L 被激活，并在1/2 d 時其活性達(dá)到最大值（2 352.3±296.4）U/mg 蛋白（P<0.05），隨后組織蛋白酶-L 活力顯著下降，直到第4 天時組織蛋白酶-L 失活，失去其原有活力，活力值較對照組比下降約一倍。由圖4 可看出，蛋白質(zhì)在1d 時開始降解，而且這個過程是持續(xù)且不斷加劇的，而在這之前，組織蛋白酶-L 已經(jīng)被激活，說明組織蛋白酶-L 的激活可能會對蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生影響。 3 d 后，蛋白降解程度與組織蛋白酶-L活力呈負(fù)相關(guān)。 這與2014年Ge 等[17]報道的組織蛋白酶-L 會間接影響蛋白降解的結(jié)果相一致；caspase-3 的活力在1/2 d 之前沒有發(fā)生顯著變化（圖5b），說明在前期時其酶活性未被激活，而到1/2 d 時， 其相對活力顯著增強，caspase-3 活性被激活，1 d 時其相對活力達(dá)到最大值 （3.1139 ±0.2173）U/mg 蛋白（P<0.05），隨后呈下降趨勢，2 d 時較最高活力下降約1/2，3d 后其活力僅為最高活力的26.43%， 與對照組相比活力也下降了，并一直維持在相對穩(wěn)定的水平，說明caspase-3 活力從3 d 開始已經(jīng)失活。 其結(jié)果與2009年Kemp等[18]在羊肌肉中以及2013年Cao 等[19]在牛骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致。Caspase-3 屬于細(xì)胞凋亡中的執(zhí)行因子，有報道顯示，凋亡誘導(dǎo)分子會對組織蛋白酶-L 發(fā)生作用，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡激活因子的釋放， 從而激活下游caspase 對于蛋白質(zhì)的降解，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷[20]。 這說明了caspase-3 的激活會影響蛋白質(zhì)降解。

圖5 海參在20 ℃處理條件下內(nèi)源酶變化Fig.5 Changes of endogenous enzymes in sea cucumber under 20 ℃treatment comdition

2.6 低溫處理條件下海參自由基信號強度變化

圖6 海參在20℃處理條件下自由基信號強度變化Fig.6 Variation of free radical signal intensity at 20 ℃treatment condition

由圖6 可以看出，信號強度在1/4 d 之前是趨于穩(wěn)定的，變化并不顯著，而隨著低溫處理時間的延長，自由基被激活，開始發(fā)生作用，信號強度明顯增強， 并在1/2 d 時達(dá)到最大值1.27±0.08（×105），隨后信號強度逐漸降低，從3 d 開始信號明顯減弱，4～6 d 未檢測到明顯的自由基信號峰（數(shù)據(jù)未顯示）。 低溫處理可能會造成自由基的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的種類繁多且大多數(shù)都分布在細(xì)胞內(nèi)外，極其容易受到氧自由基的攻擊， 因此自由基信號的增強可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解。 據(jù)2010年Acharya 等[21]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的ROS 能夠通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的平衡以及細(xì)胞內(nèi)的信號來體現(xiàn)其有益作用；但是高水平的ROS 會對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成損傷，并在其中起主要的作用。 由此可知，海參低溫處理過程中自由基的產(chǎn)生對海參品質(zhì)變化起重要作用。

3 結(jié)論

隨著低溫處理時間的延長， 海參質(zhì)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，其中包括形態(tài)變化、質(zhì)構(gòu)變化（咀嚼度和硬度）和內(nèi)源酶活化、膠原溶出、蛋白降解。海參的品質(zhì)變化與組織蛋白酶L、Caspase-3 的活力，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的降解，自由基的生成有一定程度的聯(lián)系， 其中海參在1/2 d 左右時硬度相對較小，內(nèi)源酶活力相對較高，形態(tài)也未發(fā)生明顯的變化，嫩度相對較好。而隨著低溫處理時間的延長，內(nèi)源酶的激活使蛋白質(zhì)不斷發(fā)生降解，膠原溶出增加，進(jìn)而造成海參的硬度和咀嚼度下降， 嫩度發(fā)生不良變化，海參品質(zhì)下降。下一步我們可以通過控制海參內(nèi)源的理化指標(biāo)變化，改變海參的加工品質(zhì)，以獲得品質(zhì)上呈的加工產(chǎn)品。