焦天慧 蘆 宇 葉琳琳 姚 佳 莊 園 黃媛媛 趙旻陽(yáng) 呂長(zhǎng)鑫* 勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程控制中心 遼寧錦州121013 2 遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)（沈陽(yáng)）有限公司 沈陽(yáng)110121 3 錦州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心 遼寧錦州121013）

紅樹(shù)莓籽是紅樹(shù)莓在加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，約占紅樹(shù)莓鮮果質(zhì)量的10%。由于紅樹(shù)莓籽中含有原花青素、鞣花酸、黃酮等植物多酚[1]，因此，它可作為一種良好的天然抗氧化劑來(lái)源。 目前普遍采取丟棄或堆埋等手段對(duì)紅樹(shù)莓籽進(jìn)行處理，導(dǎo)致紅樹(shù)莓籽利用率極低并對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了污染[2]。原花青素（Proanthocyanidins）是一類(lèi)有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類(lèi)黃酮， 由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合而成[3-5]，廣泛存在于植物果實(shí)、種子、花和果皮中。 原花青素具有抗衰老、抗腫瘤、抗紫外和防輻射等功能，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[6]。對(duì)原花青素提取主要通過(guò)超聲波輔助法、微波輔助法、酶解法等，其中超聲波輔助法是通過(guò)超聲波在液體媒介中產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)和空化作用對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行破壞， 從而增加細(xì)胞內(nèi)各類(lèi)物質(zhì)溶出[7]。 超聲波法有著條件溫和、處理時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)， 該法適用于原花青素這類(lèi)熱穩(wěn)定性較差物質(zhì)[8-9]的輔助提取。

紫外線尤其是波長(zhǎng)為290～320 nm 的中波紫外線（UVB）可使人體產(chǎn)生紅斑，且到達(dá)真皮層致使人體皮膚出現(xiàn)曬傷、曬黑和脫皮等現(xiàn)象[10]。 目前市售防曬化妝品中的防曬成分包括甲氧基肉桂酸乙基己酯、 丁基甲氧基二苯甲?；淄楹投趸伒?， 這些成分長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外線下會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利影響[11]，因此，植物天然防曬品受到廣泛的關(guān)注。 本研究以防曬系數(shù)為指標(biāo)對(duì)樣品抗紫外活性進(jìn)行評(píng)價(jià)， 并選用簡(jiǎn)便快捷的紫外分光光度法[12-14]對(duì)樣品SPF 進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹(shù)莓籽，烘干至恒重，研磨過(guò)60 目篩；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，如吉生物科技公司；香草醛、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、濃鹽酸等，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

UV-2700 紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；SK6210HP 超聲波清洗器， 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；5804R 冷凍離心機(jī)，艾本德儀器有限公司；GT-100 振動(dòng)球磨儀， 北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用鹽酸-香草醛法[15]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 將原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 加入10 mL 具塞試管中并加入6 mL 的40 mg/mL 香草醛-甲醇溶液，再加入3 mL濃鹽酸，混勻后置于30 ℃水浴鍋中顯色1 h，以甲醇為空白對(duì)照，在500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并繪制曲線。 得到回歸方程：y=1.7703x-0.0078，R2=0.9997，式中x 為質(zhì)量濃度，y 為樣液在500 nm 波長(zhǎng)處吸光度，該曲線在0.10～0.50 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 適用于紅樹(shù)莓籽提取液中原花青素質(zhì)量濃度計(jì)算。

1.2.2 紅樹(shù)莓籽原花青素的提取 稱(chēng)取1.00 g 紅樹(shù)莓籽粉于100 mL 錐形瓶中， 按料液比1∶30 g/mL 加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液搖勻。在設(shè)定溫度下進(jìn)行超聲波處理， 抽濾后將濾液在6 000 r/min下離心10 min 并將上清液定容至50 mL 待測(cè)。

1.2.3 紅樹(shù)莓籽原花青素濃度的測(cè)定 取1.2.2節(jié)中定容后樣液1 mL 按1.2.1 節(jié)操作顯色后測(cè)定吸光度， 由回歸方程得出樣液中原花青素濃度并計(jì)算原花青素得率，計(jì)算公式：

式中：C——定容后樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V——待測(cè)液總體積，mL；d——稀釋倍數(shù)；M——紅樹(shù)莓籽質(zhì)量，g。

1.2.4 提取工藝優(yōu)化 以原花青素得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響得率的各因素進(jìn)行考察，篩選出對(duì)得率影響較為顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化并確定其水平范圍。單因素試驗(yàn)中，超聲波功率的考察水平為160，170，180，190，200 W； 超聲波處理溫度的考察水平為30，40，50，60，70 ℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察水平為60%，65%，70%，75%，80%； 超聲波處理時(shí)間的考察水平為15，20，25，30，35 min。 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)上述4 個(gè)主要影響因素進(jìn)行Box-Benhnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平如表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels used in response surface design

1.2.5 紫外分光光度法測(cè)定SPF 準(zhǔn)確稱(chēng)取紅樹(shù)莓籽原花青素提取物和市售化妝品Ⅰ、 Ⅱ（標(biāo)示SPF 分別為35，25）各1.000 g 溶于100 mL 乙醇中， 超聲波處理使提取物及化妝品充分溶解，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，棄去最初10 mL 濾液，其余濾液作為10 mg/mL 母液。 將紅樹(shù)莓籽原花青素母液分別稀釋至0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，4.00，6.00，8.00 mg/mL 并倒入1 cm 石英比色皿中， 利用紫外分光光度計(jì)在290～320 nm 波段內(nèi)，每隔5 nm 對(duì)樣液的吸光度進(jìn)行3 次測(cè)定，乙醇做空白對(duì)照并計(jì)算樣液SPF 值[16]。 利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣液在紫外波段內(nèi)的吸光度， 依據(jù)Mansur[17]的方程對(duì)樣液SPF 進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：

式中：CF——校正因子， 值為10；EEλ——波長(zhǎng)λ 下輻射出的紅斑效應(yīng)；Iλ——太陽(yáng)光譜強(qiáng)度；Aλ——λ 波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)。公式（2）中EEλ×Iλ是由Sayre[18]測(cè)得的SPF 計(jì)算規(guī)范系數(shù)（表2）各波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)系數(shù)的總和為1。

表2 SPF 計(jì)算規(guī)范系數(shù)Table 2 Normalized product function used in the calculation of SPF

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對(duì)原花青素得率影響分析 超聲波在溶劑中產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)和空化作用會(huì)破壞紅樹(shù)莓籽細(xì)胞，從而提高原花青素的溶出量。由圖1 可知，隨著超聲波功率的增加，原花青素的得率不斷上升并在180 W 達(dá)到峰值； 之后得率開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 因過(guò)高的功率會(huì)增加液體媒介的機(jī)械振動(dòng)并產(chǎn)生熱量， 會(huì)破壞原花青素的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致得率下降。因此，確定180 W 為最佳提取功率并設(shè)置該功率為響應(yīng)面優(yōu)化的零點(diǎn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)原花青素得率的影響分析 由圖2 可知，在30～50 ℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，得率也逐漸增加， 是因溫度升高導(dǎo)致分子熱運(yùn)動(dòng)加劇， 紅樹(shù)莓籽中原花青素與溶劑間作用增強(qiáng)從而溶出量增加；但原花青素屬于熱敏性物質(zhì)，所以當(dāng)溫度升至50 ℃時(shí)，得率開(kāi)始呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。 因此，原花青素的適宜提取溫度為50 ℃。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響如圖3 所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，原花青素得率也逐漸提高，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)75%達(dá)到峰值；之后原花青素得率開(kāi)始呈現(xiàn)降低趨勢(shì)， 可能是由于一些極性與乙醇相近的雜質(zhì)溶解量增加， 阻礙了原花青素溶出。 因此確定75%為乙醇最佳提取條件并進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率影響分析 由圖4 可知，隨著超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)，得率迅速上升并在25 min 達(dá)到峰值14.32 mg/g； 但得率在25 min 之后開(kāi)始下降， 可能是由于超聲波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得溶質(zhì)和溶劑間的熱效應(yīng)增強(qiáng)， 使原花青素的結(jié)構(gòu)受到破壞；此外，原花青素自身的酚羥基也會(huì)與溶劑中的游離自由基結(jié)合而被氧化， 進(jìn)而導(dǎo)致得率降低。 因此，超聲波處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，選定25 min 為最佳提取時(shí)間。

圖1 超聲波功率對(duì)原花青素得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the extraction rate of proanthocyanidins

圖2 提取溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction rate of proanthocyanidins

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins

圖4 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the extraction rate of proanthocyanidins

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.2.1 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)結(jié)果及分析 選取超聲波功率（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、提取時(shí)間（D）為考察因素，以原花青素得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Benhnken 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表3。 其中1～24 號(hào)試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，25～29號(hào)試驗(yàn)為零點(diǎn)試驗(yàn)用來(lái)估計(jì)誤差。 通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表3 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，所得回歸方程為：

Y=14.44+0.055A-0.11B+0.52C+0.25D-0.14AB-0.07AC-0.53AD+0.73BC-0.38BD-0.22CD-1.32A2-0.87B2-1.00C2-0.14D2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

由表4 方差分析結(jié)果可知， 對(duì)紅樹(shù)莓籽原花青素提取所建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型極顯著（P＜0.01）； 模型決定系數(shù)R2=0.9915， 失擬項(xiàng)不顯著（P=0.997＞0.05）， 校正系數(shù)R2adj=0.9829 說(shuō)明模型能夠較好地描述超聲波提取紅樹(shù)莓籽原花青素過(guò)程中得率隨提取條件的變化規(guī)律， 可通過(guò)該模型對(duì)紅樹(shù)莓籽中原花青素的提取結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。 由F 值可知，4 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（B）＞超聲波功率（A）；由模型中各項(xiàng)P 值可知，交互項(xiàng)中超聲波功率和提取溫度（AB）、超聲波功率和提取時(shí)間 （AD）、 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)（BC）、提取溫度和提取時(shí)間（BD）、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間（CD）的交互作用對(duì)原花青素的得率影響顯著。

2.2.2 響應(yīng)面各因素間交互作用分析 圖5 中a～f 是反映各因素交互作用與原花青素得率間關(guān)系的響應(yīng)面3D 圖及等高線圖。根據(jù)響應(yīng)面所呈現(xiàn)的形狀、陡峭程度及其等高線的變化情況，分析超聲波功率、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)間交互作用對(duì)原花青素得率的影響。 圖a 為超聲波功率-提取溫度交互作用與得率關(guān)系的響應(yīng)面圖，隨著提取溫度和功率逐漸增加， 原花青素得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)， 且等高線圖b 趨于橢圓形，證明交互作用對(duì)得率影響較為顯著；圖c 為乙醇體積分?jǐn)?shù)-提取溫度與得率關(guān)系的響應(yīng)面圖，圖形呈較為陡峭的拱形且等高線圖為橢圓形， 說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的交互作用對(duì)得率的影響極為顯著； 圖e 中提取時(shí)間在低水平與高水平所對(duì)應(yīng)的得率差別較小， 但隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。 由此可知，超聲波輔助提取技術(shù)可以有效地在短時(shí)間內(nèi)使原花青素溶出。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the established regression model

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plots

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)模型可知預(yù)測(cè)原花青素最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75.35%、提取功率178.30 W、 提取溫度47.60 ℃、 提取時(shí)間30.00 min。 在此條件下原花青素得率理論值達(dá)14.65 mg/g。 為驗(yàn)證預(yù)測(cè)工藝參數(shù)的可行性，考慮實(shí)際操作條件， 將最佳工藝調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取功率180 W、提取溫度48 ℃、提取時(shí)間30 min。 進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，原花青素得率分別為14.62，14.55，14.57 mg/g， 平均值14.58 mg/g 與預(yù)測(cè)值接近，證明模型預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)實(shí)際可行。

2.3 紅樹(shù)莓籽原花青素抗紫外活性評(píng)價(jià)

長(zhǎng)期紫外線照射會(huì)導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生老化而導(dǎo)致皮膚腫瘤發(fā)病率升高[19]，但目前市售防曬化妝品中主要抗紫外成分多以化學(xué)成分為主， 存在一定安全隱患， 因此天然抗紫外成分的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為化妝品的主要研發(fā)方向。 SPF 的測(cè)定方法主要包括人體法、無(wú)毛小鼠法和體外分光光度法等[20]，由于人體法可能對(duì)人體皮膚產(chǎn)生損傷且無(wú)毛小鼠法操作繁瑣， 因此本文選用體外分光光度法對(duì)提取所得紅樹(shù)莓籽原花青素及市售化妝品進(jìn)行SPF 的測(cè)定， 以評(píng)價(jià)紅樹(shù)莓籽原花青素的抗紫外能力并與市售化妝品進(jìn)行對(duì)比。

利用紫外分光光度計(jì)對(duì)0.1～10 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)樣品及兩種市售防曬霜Ⅰ、 Ⅱ進(jìn)行290～320 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度的測(cè)定，結(jié)果如圖6 所示。 樣品質(zhì)量濃度低于2 mg/mL 時(shí)，樣品在各波長(zhǎng)處吸光度均隨濃度升高而提升； 防曬霜Ⅰ與0.8 mg/mL 樣品在各波長(zhǎng)吸光度接近， 在310 nm后吸光度略高于0.8 mg/mL 樣品， 但310～320 nm波長(zhǎng)范圍的規(guī)范系數(shù)較低， 使防曬霜Ⅰ的SPF 低于0.8 mg/mL 樣品。質(zhì)量濃度高于4 mg/mL 的樣品在290～320 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)整體吸光度較高，2 mg/mL 樣品雖然在305 nm 處吸光度與4 mg/mL 樣品接近， 但由于在300 nm 和310 nm 處吸光度明顯低于4 mg/mL，同時(shí)規(guī)范系數(shù)中這兩處波長(zhǎng)的系數(shù)常量較高， 導(dǎo)致2 mg/mL 樣品的SPF 與4 mg/mL樣品有較大差距。

圖6 紅樹(shù)莓籽原花青素吸光度分布Fig.6 Absorbance distribution of 0.1-10 mg/mL proanthocyanidins from 290 nm to 320 nm

圖7和圖8 分別反映了紅樹(shù)莓籽原花青素質(zhì)量濃度在0.1～1.2 mg/mL 及0.1～10 mg/mL 范圍內(nèi)SPF 的變化情況。 由圖7 可知，紅樹(shù)莓籽原花青素質(zhì)量濃度在0.1～1.2 mg/mL 的范圍內(nèi)，其SPF 隨著濃度的增長(zhǎng)逐漸上升，且二者呈一定線性關(guān)系，y=8.1919x-7.5555，R2=0.9521 說(shuō)明有較好的相關(guān)性。當(dāng)紅樹(shù)莓籽原花青素質(zhì)量濃度上升到4 mg/mL時(shí)，SPF 逐漸趨于平穩(wěn)，這可能是由于質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時(shí)紅樹(shù)莓籽原花青素溶液對(duì)290～320 nm波長(zhǎng)范圍的紫外線吸收逐漸飽和導(dǎo)致SPF 基本不變。

利用紫外分光光度法對(duì)市售防曬霜Ⅰ、 Ⅱ的SPF 進(jìn)行測(cè)定，防曬霜實(shí)際SPF 均低于標(biāo)示SPF，與Fonseca[21]所敘述結(jié)果一致。 圖9 對(duì)比了兩種防曬霜與0.8 mg/mL 和10 mg/mL 紅樹(shù)莓籽原花青素的SPF，結(jié)果表明，質(zhì)量濃度均為10 mg/mL 時(shí)紅樹(shù)莓籽原花青素SPF 遠(yuǎn)高于市售防曬霜的SPF；質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 紅樹(shù)莓籽原花青素提取物SPF 可達(dá)24.07，略高于楊健[22]所得葡萄籽原花青素SPF，與市售防曬霜Ⅰ的實(shí)際SPF 接近，說(shuō)明紅樹(shù)莓籽原花青素在防曬化妝品領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

圖7 紅樹(shù)莓籽提取物濃度與SPF 的線性關(guān)系Fig.7 Linear relationship between SPF and proanthocyanidins concentration （0.1-1.2 mg/mL）

圖8 紅樹(shù)莓籽提取物濃度對(duì)SPF 的影響Fig.8 Effect of proanthocyanidins concentration on SPF （0.1-10 mg/mL）

圖9 紅樹(shù)莓籽提取物與防曬化妝品的SPF 對(duì)比Fig.9 Comparison of SPF between proanthocyanidins and sunscreens

3 結(jié)論

利用超聲波輔助提取法對(duì)紅樹(shù)莓籽中原花青素進(jìn)行提取，并通過(guò)Box-Benhnken 設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到了超聲功率180 W、提取溫度57℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)75.5%、提取時(shí)間30 min 的最優(yōu)工藝參數(shù)， 在此條件下紅樹(shù)莓籽原花青素得率為14.58 mg/g。

以SPF 為指標(biāo)， 對(duì)所得紅樹(shù)莓籽原花青素進(jìn)行抗紫外活性研究， 結(jié)果表明紅樹(shù)莓籽原花青素質(zhì)量濃度在0.1～1.2 mg/mL 范圍內(nèi)，其SPF 與濃度成線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.9521；質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 時(shí)SPF 可達(dá)24.07，高于市售SPF35 防曬霜的實(shí)際SPF； 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)其SPF 可達(dá)42.84， 質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大值52.90顯著高于市售化妝品標(biāo)示SPF， 說(shuō)明紅樹(shù)莓籽原花青素具有較強(qiáng)的抗紫外能力。 本研究為紅樹(shù)莓籽加工副產(chǎn)物再利用及紅樹(shù)莓籽提取物在化妝品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。