王婧瑩 張國(guó)芳 杜 鵬 劉麗波 李曉東 李 春

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030）

氧化損傷是導(dǎo)致機(jī)體衰老的根本原因， 同時(shí)也是誘發(fā)多類疾病的一個(gè)重要原因[1-2]。 抗氧化食品的研制成為食品科學(xué)研究的重要課題之一。 發(fā)酵乳是目前公認(rèn)的具有抗衰老作用的食品[3-5]。 保加利亞乳桿菌是乳制品工業(yè)生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵劑之一， 環(huán)境中存在的和菌株自身代謝過程中產(chǎn)生的活性氧嚴(yán)重威脅到菌株的生長(zhǎng)和生存[6-8]。 提高乳酸菌的抗氧化能力， 使乳酸菌具有較強(qiáng)的抗氧化活性， 對(duì)發(fā)酵乳制品生產(chǎn)和保健功能具有重要意義[9]。 NaCl 是生物體中重要的無機(jī)鹽成分，維持著整個(gè)細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的完整， 參與多種生理生化反應(yīng)。Prasad 等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈉刺激后的乳酸菌對(duì)冷凍干燥等環(huán)境抗脅迫性增加。 那么，NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌的抗氧化能力是否同樣有提高作用，值得研究。

本文初步研究氯化鈉對(duì)保加利亞乳桿菌抗氧化的影響， 對(duì)比氯化鈉不同添加量孵育的菌株的抗氧化活性的差別， 為研制優(yōu)良發(fā)酵劑提供理論支持。

1 材料與儀器

供試菌株為德式乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 MRS 培養(yǎng)基，天津天力化學(xué)試劑公司；所有抗氧化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GL-21M 高速冷凍離心機(jī)， 上海市離心機(jī)械研究所； 紫外-可見分光光度計(jì)DU 800， 美國(guó)Beckman；超聲細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株活化

將菌株于-20 ℃冷凍保存，使用前將凍存菌按2%（V/V）的接種量接種到100 mL 的MRS 培養(yǎng)基中，振勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，傳代活化2 次，保證菌數(shù)大于108CFU/mL，備用。

2.2 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

活化2 次的菌液接種在100 mL 的MRS 培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)，每2 h 取5 mL，測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm 處的吸光值（OD600nm），分別以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，吸光值（OD600nm）為縱坐標(biāo)作圖，得出生長(zhǎng)曲線。

2.3 NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)代謝的影響

活化2 次的菌液按2%（V/V）接種量分別接入10 mL 氯化鈉含量不同的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫12 h 后， 測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm 處的吸光值（OD600nm），分別以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，吸光值（OD600nm）為縱坐標(biāo)作圖，得出曲線。

2.4 保加利亞乳桿菌耐H2O2 能力的測(cè)定

將活化兩次的菌液，平均分為4 份，每份10 mL，離心收集菌體（4 000 r/min，15 min，4 ℃）。 將菌體沉淀分別重懸于10 mL MRS 培養(yǎng)基中 （使H2O2終濃度分別為0，0.5，1，2 mmol/L）。37 ℃恒溫培養(yǎng)， 在0，2，4 h 時(shí)取樣以不同稀釋度涂布在MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h， 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)不同濃度的菌落數(shù)，確定其H2O2致死濃度及亞致死濃度。

2.5 NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌耐H2O2 能力的影響

將活化后菌液接種在氯化鈉添加量為0.1%～1%的10 mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后收集菌體，接種在H2O2濃度為1 mmol/L 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，以不同稀釋度涂布，計(jì)算存活率，重復(fù)試驗(yàn)3 次。

式中，AX——各濃度NaCl 脅迫時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果；APBS——PBS 計(jì)數(shù)結(jié)果；A0——各濃度NaCl 未脅迫時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.6 保加利亞乳桿菌體外抗氧化活性指標(biāo)的測(cè)定

2.6.1 樣品的處理 活化的菌液接種在氯化鈉含量不同的100 mL MRS 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)12 h 后，收集菌體，重懸于100 mL 無菌去離子水中調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，所得菌懸液平均分為兩組，一組作為完整細(xì)胞菌懸液組（Intact cell，IC），另一組用于細(xì)胞破碎物的制備。

菌懸液在冰浴中超聲粉碎時(shí)間為10 min （超聲10 s， 間隔15 s）， 離心（6 000 r/min，10 min，4℃）得到的上清液即為乳酸菌無細(xì)胞提取物（Cellfree Extract，CFE）備用。

2.6.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參考田豐偉[11]和Ianniello R G[12]的方法并加以改進(jìn)：樣品組為樣品2 mL 和0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液1 mL，空白組為樣品加無水乙醇溶液，對(duì)照組為蒸餾水代替樣品，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)液離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液于517 nm 測(cè)吸光度。

式中：Ai——樣品組測(cè)得的吸光度；Aj——空白組測(cè)得的吸光度；A0——對(duì)照組測(cè)得的吸光度。

2.6.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 參考Yan S[13]和Herraiz T[14]的方法并加以改進(jìn)：取樣品1mL 分別加入5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、5 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、3 mmol/L 雙氧水溶液各1 mL，空白組則用等體積的蒸餾水代替樣品，混勻后37 ℃水浴恒溫反應(yīng)15 min， 反應(yīng)液6 000 r/min 離心10 min， 取上清液于510 nm 測(cè)吸光度， 用蒸餾水調(diào)零。

式中Ax——樣品組測(cè)得的吸光度，A0——空白組測(cè)得的吸光度。

2.6.4 樣品還原能力的測(cè)定 取樣品0.5 mL 分別加入1%鐵氰化鉀溶液、0.2 mol/L PBS 溶液（pH=6.6）各0.5 mL，混勻后50 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min， 反應(yīng)液降至室溫后加入0.5 mL 三氯乙酸（10%），混勻后反應(yīng)液4 500 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液加入0.1%三氯化鐵、蒸餾水各1 mL，于700 nm 處測(cè)吸光度，用蒸餾水調(diào)零，其中以L-半胱氨酸為標(biāo)品[15-17]。

2.7 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有數(shù)據(jù)均為3 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果，均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Excel 和SPSS 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 繪圖借助Excel 軟件完成，相關(guān)性分析采用相關(guān)系數(shù)法，以P＜0.05 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

本試驗(yàn)研究保加利亞乳桿菌穩(wěn)定期時(shí)的生長(zhǎng)情況，因此測(cè)定了保加利亞乳桿菌在MRS 培養(yǎng)基中的吸光值（OD600nm），并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1 所示。 由圖可知保加利亞乳桿菌在12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，OD 值在2.3～2.4。 因此，將菌株孵育12 h 以此研究保加利亞乳桿菌穩(wěn)定期時(shí)的抗氧化情況。

3.2 NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)代謝的影響

NaCl 在一定濃度范圍內(nèi)可以維持微生物細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡， 超過一定量則會(huì)使細(xì)胞死亡[18-20]。 所以研究培養(yǎng)基中的NaCl 濃度范圍是首要任務(wù)。 本試驗(yàn)測(cè)定了活化后的菌株在添加不同濃度NaCl 的MRS 培養(yǎng)基中的吸光值（OD600nm），并繪制生長(zhǎng)曲線，如圖2 所示。

圖1 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth of Lactobacillus bulgaricus in medium

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl 對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Growth of Lactobacillus bulgaricus in different concentrations of NaCl

如圖2 可知，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%～0.5%之間時(shí)菌體濃度變化較小，而隨著培養(yǎng)基中NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，菌體濃度不斷降低，當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%時(shí)OD600nm小于2 當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)菌株的生長(zhǎng)完全受到延滯。 因此，研究NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌抗氧化影響時(shí)NaCl 的添加量在0%～1%為宜。

3.3 過氧化氫脅迫亞致死值與致死值

亞致死水平的定義為脅迫作用后不限制菌體生長(zhǎng)的最低脅迫水平， 致死水平為脅迫作用后活菌數(shù)顯著下降的脅迫水平[21]。 本試驗(yàn)在確定保加利亞乳桿菌具有抗氧化的基礎(chǔ)上， 研究保加利亞乳桿菌過氧化氫脅迫亞致死值與致死值， 在其亞致死值基礎(chǔ)上作為氧化脅迫條件，研究NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌耐受性的影響。

由圖3 可知， 保加利亞乳桿菌的過氧化氫耐受能力較低，H2O2濃度為1 mmol/L 時(shí)， 菌體的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，菌體進(jìn)入停滯的狀態(tài)，在4 h期間菌落沒有生長(zhǎng)，但此時(shí)的菌體沒有死亡，一旦去掉脅迫，又可以進(jìn)入正常的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)濃度為2 mmol/L 時(shí)活菌數(shù)明顯下降。 因此可以認(rèn)為亞致死值為1 mmol/L，致死值為2 mmol/L。

3.4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌抗H2O2 能力的影響

本試驗(yàn)利用平板菌落計(jì)數(shù)法研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl 對(duì)菌株耐H2O2的影響，確定最適NaCl 添加量。 由圖4 可知，1 mmol/L H2O2脅迫下0.1%～0.3%范圍內(nèi)的NaCl 均能提高菌的存活率， 其中NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)可得到較高的抗氧化菌株，存活率為54.76%約是對(duì)照組的3 倍。

圖3 保加利亞乳桿菌在不同H2O2 濃度條件下的活菌數(shù)Fig.3 Growth of Lactobacillus bulgaricus in MRS adjusted to different H2O2 concentrations

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl 對(duì)菌體抗氧化的影響Fig.4 The antioxidant capacity of Lactobacillus bulgaricus in different concentrations of NaCl

3.5 保加利亞乳桿菌體外抗氧化能力的測(cè)定

3.5.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 DPPH 在517 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，向其中加入自由基清除劑時(shí)，可以結(jié)合或替代DPPH 自由基，使自由基數(shù)量減少，吸光度變小，借此可評(píng)價(jià)清除自由基的能力[11]。 即通過在517 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品清除DPPH 的效果，來計(jì)算抗氧化能力。

按試驗(yàn)方法測(cè)得的完整細(xì)胞懸液（IC）和無細(xì)胞提取物（CFE）對(duì)DPPH 自由基清除結(jié)果如圖5所示。

如圖5 可知， 保加利亞乳桿菌對(duì)DPPH 有清除作用，加入不同濃度的NaCl 對(duì)清除作用有不同程度的影響。 NaCl 添加量為0.1%～0.2%時(shí)，完整細(xì)胞菌懸液組和無細(xì)胞提取物組對(duì)DPPH 自由基清除率明顯提高，其中在0.2%時(shí)達(dá)到最大值分別為45.53%，35.29%， 明顯高于對(duì)照組的39.67%，19.12%。 之后隨著NaCl 濃度的增加，清除率相差不大。將兩組數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，IC 組DPPH 自由基清除率明顯高于CFE 組， 即無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH清除能力較弱， 從圖中發(fā)現(xiàn)添加0.2% NaCl 的無細(xì)胞提取物組清除率提高程度明顯大于完整細(xì)胞懸液，這可能說明NaCl 主要促進(jìn)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的生成從而進(jìn)一步提高清除DPPH 自由基能力。

圖5 不同樣品清除DPPH 自由基的能力Fig.5 Different samples of DPPH scavenging ability

3.5.2 羥自由基清除能力的測(cè)定 按試驗(yàn)方法測(cè)得的羥自由基清除結(jié)果如圖6 所示。如圖可知，保加利亞乳桿菌對(duì)羥自由基有一定的清除能力，無細(xì)胞提取物組的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于完整細(xì)胞懸液組， 可推測(cè)保加利亞乳桿菌對(duì)羥自由基的清除能力主要是胞內(nèi)物質(zhì)決定的。 當(dāng)添加不同量的NaCl時(shí)，清除能力不同，但同對(duì)照組12.44%，98.27%相比，均略有提高。 同樣在0.2%時(shí)取得最大值分別為18.45%，98.72%。 從數(shù)據(jù)上分析NaCl 對(duì)無細(xì)胞提取物清除羥自由基的影響不大， 對(duì)完整細(xì)胞懸液略有提高，推測(cè)NaCl 主要通過促進(jìn)胞外抗氧化物質(zhì)的生成從而進(jìn)一步提高清除羥自由基能力。

圖6 保加利亞乳桿菌懸液（a）和無細(xì)胞提取物（b）對(duì)羥自由基清除能力Fig.6 Scavenging of hydroxyl free radicals by intact cells （a）and free-cell extracts （b）of Lactobacillus bulgaricus

3.5.3 樣品還原能力的測(cè)定 有機(jī)化合物的還原活性與抗氧化性之間存在著一定的相關(guān)性。 還原電位越高的有機(jī)化合物給出電子的能力越強(qiáng)，這樣其可能的抗氧化性能也有可能比較強(qiáng)， 因此測(cè)定樣品的還原能力也常作為測(cè)定氧化活性的指標(biāo)之一[22-23]。按試驗(yàn)方法測(cè)得的樣品還原能力結(jié)果如表1 所示。

由表1 可知， 所有菌體還原能力在0.91～21.86 μmol/L 之間， 完整細(xì)胞懸液總體還原性大于無細(xì)胞提取物， 即保加利亞乳桿菌具有一定還原性。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl 處理的菌株還原性均不同，0.1%～0.3% NaCl 能增強(qiáng)保加利亞乳桿菌還原性，其中0.2% NaCl 組還原性最強(qiáng)。

表1 不同NaCl 處理的乳酸菌分離物還原性Table 1 Reducing activities of different concentrations of NaCl

4 討論與分析

乳酸菌是一類不屬于抗氧化劑但存在抗氧化活性的食品級(jí)微生物[24-25]。 由于菌株的濃度，生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)抗氧化性有不同程度的影響， 因此本試驗(yàn)選取對(duì)象菌株保加利亞乳桿菌穩(wěn)定時(shí)期進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。 試驗(yàn)結(jié)果確定保加利亞乳桿菌在12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期。

畢潔等[29]研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的NaCl 與細(xì)胞的生長(zhǎng)量和多糖產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系。 NaCl 是生命活動(dòng)中必不可少的無機(jī)鹽，適量濃度的NaCl 不僅能夠增加生物量[20]、影響微生物群落結(jié)構(gòu)[30]還能提高乳酸菌凍干存活率[31]，但過量的NaCl 會(huì)使細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡。因此本試驗(yàn)通過OD600nm值在不影響菌的正常生長(zhǎng)情況下初步確定研究NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.1%～1%。

很多研究學(xué)者利用評(píng)價(jià)抗氧化劑體外抗氧化能力的指標(biāo)和方法來評(píng)價(jià)乳酸菌的抗氧化活性[6，17，26]。 這些評(píng)價(jià)指標(biāo)包括體外氧化脅迫耐受（過氧化氫、超氧陰離子等）、脂質(zhì)過氧化抑制、自由基清除（DPPH 自由基和羥自由基）、螯合金屬離子、抗氧化酶活力等。本試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果最終選擇通過H2O2耐受、清除DPPH 自由基和羥自由基能力以及還原性4 種指標(biāo)確定NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌抗氧化的影響， 并確定最優(yōu)添加量的值。

試驗(yàn)結(jié)果表明在H2O2亞致死值為1 mmol/L脅迫下0.2% NaCl 處理后的保加利亞乳桿菌存活率提升最高是對(duì)照組的3 倍。 對(duì)完整細(xì)胞懸液和無細(xì)胞提取物的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)， 在每個(gè)指標(biāo)下其抗氧化活性優(yōu)勢(shì)各不相同， 完整細(xì)胞懸液對(duì)DPPH 自由基清除能力及還原性強(qiáng)于無細(xì)胞提取物， 而在羥自由基清除方面無細(xì)胞提取物的優(yōu)勢(shì)尤為明顯， 是否表明保加利亞乳桿菌引起抗氧化活性的物質(zhì)各不相同， 無細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基清除率高達(dá)90%以上， 分析一方面可能跟樣品量有關(guān)， 另一方面可能說明保加利亞乳桿菌抗氧化活性主要表現(xiàn)在羥自由基的清除能力上。 雖然當(dāng)前有許多對(duì)乳酸菌抗氧化機(jī)理的研究報(bào)道，但對(duì)于乳酸菌抗氧化脅迫作用的具體物質(zhì)是什么還沒有定論。 目前最被認(rèn)可的一種說法就是乳酸菌胞內(nèi)外抗氧化物質(zhì)和氧化還原調(diào)控系統(tǒng)共同組成了活性氧和自由基清除系統(tǒng)， 進(jìn)而達(dá)到抗氧化脅迫的作用[27，32]。 從數(shù)據(jù)來看，0.2% NaCl 將無細(xì)胞提取物DPPH 清除率從19.12%提高到35.29%，而完整細(xì)胞懸液的清除能力提升較小， 羥自由基清除率略有提高，從12.44%提高到18.45%，無細(xì)胞提取物還原能力提高了一倍多，因此，從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＜0.05 及數(shù)據(jù)結(jié)果來看，NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌的抗氧化性主要體現(xiàn)在耐H2O2能力、DPPH 自由基清除能力以及還原能力。 那么，NaCl 提高保加利亞乳桿菌的抗氧化機(jī)制是否是NaCl 能促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生， 而這種抗氧化物質(zhì)是否存在細(xì)胞內(nèi)且更易與DPPH 結(jié)合替代還需要進(jìn)一步研究，也為研究乳酸菌氧化機(jī)制提供一些參考。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過H2O2耐受性、利用DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原活性作為體外抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)初步研究NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌抗氧化活性的影響， 本試驗(yàn)取得研究結(jié)論如下。

1）保加利亞乳桿菌在12 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，0.1%～0.5%的NaCl 能提高菌株的生物量， 大于2%菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制。NaCl 能夠不同程度地影響保加利亞乳桿菌生物量。

2）NaCl 在0.1%～0.3%范圍內(nèi)能不同程度地減弱H2O2對(duì)保加利亞乳桿菌的氧化損傷，提高菌體抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)乳酸菌對(duì)H2O2脅迫的耐受性，提高活菌率，總體比較0.2%NaCl 抗氧活性最好且NaCl 對(duì)保加利亞乳桿菌的抗氧化性主要體現(xiàn)在耐H2O2能力、DPPH 自由基清除能力以及還原能力。

3）完整細(xì)胞懸液對(duì)DPPH 自由基清除及還原性有較高的活性， 無細(xì)胞提取液對(duì)羥自由基的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于完整細(xì)胞懸液。