余鈺驄 姚菊明* 應(yīng)鐵進

（1 浙江理工大學 杭州310018 2 浙江大學食品科學與營養(yǎng)系 杭州310058）

植物多糖具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤，抗炎，抗凝血，抗病毒，抗輻射，降血糖和調(diào)節(jié)血脂[1]。靈芝多糖是一種植物多糖， 對癌癥和炎癥具有最強的抵抗力，可增強免疫功能。增強人體免疫功能是靈芝水溶性多糖的主要機制之一。 對于多糖的抗腫瘤活性，通?？梢约せ蠲庖呦到y(tǒng)。 因此，大量細胞因子被分泌并間接抑制。 促進體外脾細胞的增殖，增強DNA 聚合酶α 的活性，促進白細胞介素（IL）的分泌，實現(xiàn)其免疫功能。 抑制免疫功能間接抑制腫瘤細胞的生長和增殖， 甚至殺死腫瘤細胞[2]。 研究表明，一些靈芝多糖可以通過調(diào)節(jié)機體的免疫力，刺激免疫細胞成熟，分化和增殖，并使免疫狀態(tài)從低到正?；謴?fù)。腫瘤細胞受到抑制，從而間接發(fā)揮其抗腫瘤作用[3]。

通過前期的研究， 發(fā)現(xiàn)靈芝結(jié)構(gòu)多糖水解物的提取溫度為131 ℃，水解時間為4 h 6 min，酸濃度為0.1 mol/L， 可以得到抗氧化性和得率都較好的多糖成分[4]。 分離純化后，得到兩種多糖單體組分GLSP1 和GLSP2[5]。目前還沒有關(guān)于靈芝結(jié)構(gòu)多糖水解產(chǎn)物免疫活性的報道。 本研究從靈芝結(jié)構(gòu)多糖水解物中分離純化出兩種多糖單體進行細胞免疫測定，并選擇兩種典型的脾細胞和巨噬細胞免疫功能模型。 探討靈芝多糖的抗腫瘤和免疫功能。 測定的參數(shù)包括GLSP1 和GLSP2 對小鼠脾細胞的增殖率，GLSP 對腹腔巨噬細胞活性和存活率的影響， 以及對小鼠細胞產(chǎn)生NO 的含量的測定。 TNF-α 的影響，以及對LPS 誘導過的PM 的活性抑制作用。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗材料為赤靈芝， 位于浙江龍泉市靈芝基地。

1.2 試劑

胎牛血清，購自四季青生物工程材料有限公司； 刀豆蛋白ConA， 購自sigma 公司（C5275）；MTT，購自碧云天生物（ST316）；0.2 μmol/L 孔徑濾膜，購自millipore 公司；脂多糖LPS，sigma 公司產(chǎn)品（Cat.L2880-10 mg，Lot.011M4001V）；一氧化氮檢測試劑盒， 購自Biyuntian Biological（Cat.S0021）；中性紅試劑，購自天津凱通化學試劑有限公司（20100710）；TNF-α Elisa 試劑盒，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司（Cat EK2821，Lot 128230633）。

1.3 儀器與設(shè)備

320R 臺式冷凍離心機， 德國Hettich；FE20 pH 計， 梅特勒-托利多 （上海）有限公司；UV-1750UV-Vis 分光光度計，Shimadzu Corporation，Japan；MIR-254 恒溫試驗箱，日本三洋電器集團；AF30AS 制冰機， 意大利斯科茨曼；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴，浙江省嘉興市君思儀器設(shè)備廠；BSA223S電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；3111 細胞培養(yǎng)箱，Thermo 公司；680 酶標儀，Bio-Rad 公司。

1.4 試驗動物

清潔級Balb/c 小鼠，8～10 周齡， 購自上海西普爾貝凱實驗動物有限公司， 動物許可證號：SCXK（滬）2008-0016。

2 試驗方法

2.1 兩種多糖單體的制備

從靈芝結(jié)構(gòu)中分離純化多糖后制備兩種多糖單體[4-5]。

2.2 脾細胞制備

通過頸脫位處死小鼠，用75%的酒精消毒，并將脾臟置于含有PBS 的培養(yǎng)皿中。用5 mL 注射塞研磨，混合并通過200 目無菌雙尼龍篩過濾。合并濾液，1 500 r/min×5 min；棄上清，搖勻，加入少量破碎的紅色裂解液， 用PBS 中和，1 500 r/min×5min；棄去上清液，用含有10%FBS 的1 640 培養(yǎng)基輕輕移液，重懸沉淀[6]。

2.3 脾細胞的增殖試驗

2.3.1 靈芝結(jié)構(gòu)多糖GLSP1 和GLSP2 的配制ConA 組：5 μg/mLConA；

GLP1，GLP2 均為各自稀釋成8，40，200，1 000，5 000 μg/mL；

GLP1，GLP2 均為各自稀釋成8，40，200，1 000，5 000 μg/mL 同時含5 μg/mL ConA

2.3.2 試驗操作 伴刀豆球蛋白A（Con A），也稱伴刀豆球蛋白，伴刀豆球蛋白，它是一種植物血凝素，具有很強的促有絲分裂作用，對促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)有很好的效果。 常規(guī)制備小鼠脾細胞懸液，以刀豆素為陽性對照，MTT 法觀察試驗樣品對脾細胞增殖的影響[7]。

調(diào)整小鼠脾細胞為1.5×109個/mL，100 μL/孔種板于96 孔中。 建立空白組，正常對照組，ConA組和化合物1 和2 的單一給藥組 （濃度8，40，200，1 000，5 000 μg/mL）、 化合物1 和2 聯(lián)合ConA 組 （8，40，200，1 000，5 000 μg/mL 同時含5 μg/mL ConA），于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入MTT（1 mg/mL）100 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。平板1 500 r/min×5 min，用移液管小心吸出上清液。

增殖指數(shù)=（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）

2.4 小鼠腹腔巨噬細胞（PM）的獲取

放血后通過頸脫位處死BALB/c 小鼠（降低血細胞干擾），并在75%酒精中浸泡2～3 min。腹腔注射6～8 mL 冰冷的無菌PBS 緩沖液（含肝素10 U/mL，10%胎牛血清），置于腹部1～2 min 后，靜置5 min，在無菌條件下打開腹腔，并將腹膜液吸移到離心管中。 以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄去上清液，收集巨噬細胞，用上述PBS 緩沖液洗滌細胞2 次。用含有10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度。合并后，計數(shù)細胞，調(diào)節(jié)至2×106/mL，并以每孔100 μL 和24 孔板中的1 mL 接種于96 孔板中。 在37 ℃下培養(yǎng)5%CO2后，用PBS 洗滌差異處理的細胞12 h，得到貼壁細胞，得到純化的腹膜巨噬細胞。 供試驗用[8]。

2.5 MTT 法測定試驗化合物對小鼠腹腔巨噬細胞的藥物毒性

GLSP1 和GLSP2 均為各自稀釋成1.6，8，40，200，1 000 μg/mL。 它們均用含有2%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基制備， 并通過0.22 μmol/L 過濾器過濾。

調(diào)整小鼠腹腔巨噬細胞至2×106個/mL，100 μL/孔種板于96 孔板中。設(shè)定空白對照組，正常對照組和化合物1 和2 的單一給藥組（濃度1.6，8，40，200，1 000 μg/mL），于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h 后， 每孔加入100 μL MTT （1 mg/mL）4 h，用移液管小心吸出上清液。 每孔加入150 μL酸化異丙醇，在570 nm 處測量OD 值以計算細胞存活率[9]。

細胞活力%=（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%

2.6 采用MTT 法檢測GLSP 對小鼠LPS 刺激的腹腔巨噬細胞增殖的影響

設(shè)置對照組，LPS 組及LPS+GLSP 組。 在LPS+GLSP 組加入GLSP 預(yù)孵4 h 后，再在LPS 組和LPS+GLSP 組分別加入LPS 刺激， GLSP1 和GLSP2 的濃度梯度分別設(shè)置為1.6，8，40，200，1 000 μg/mL，終質(zhì)量濃度10 mg/L。培養(yǎng)至48 h 時使用相同方法檢測[9]。

增殖抑制率（PI）=[1-（ODLPS-ODGLSP-LSP）/（ODLPS-OD對照）]×100%

2.7 試驗藥物對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO 的

影響及LPS 誘導的NO 釋放抑制

2.7.1 試驗藥物刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO將1 mL/孔接種在24 孔板上， 并將細胞差異連接12 h，并將差異粘附后的細胞用于測試。建立空白對照組， 正常對照組和化合物1 和2 的單一給藥組（濃度為1.6，8，40，200，1 000 μg/mL）； 孵育24 h 后，1 500 r/min×10 min 板離心，吸取各孔上清50 μL 轉(zhuǎn)入96 孔板中， 按順序添加Griess I 試劑和GriessII 試劑50 μL，并根據(jù)試劑盒說明制作標準曲線。 在550 nm 條件下檢測吸光度[10]。

2.7.2 GLSP 對LPS 誘導的PM 的NO 釋放的抑制作用 將腹膜液細胞濃度調(diào)節(jié)至2×106個細胞/mL，并將1 mL/孔接種在24 孔板上。 將細胞與差異物連接12 h，測試差異粘附后的細胞?？瞻讓φ战M，正常對照組，化合物1 和2 與LPS 組合（濃度1.6，8，40，200，1 000 μg/mL 同時含 5 μg/mL LPS）；孵育24 h 后，1 500 r/min×10 min 板離心，吸取各孔上清50 μL 轉(zhuǎn)入96 孔板中， 依次添加Griess I 試劑和GriessII 50 μL， 并根據(jù)試劑盒的說明制作標準曲線。在550 nm 條件下檢測吸光度[11]。

2.8 試驗化合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用的影響

將腹膜液細胞的濃度調(diào)節(jié)至2×106個細胞/mL，并將1 mL/孔接種在24 孔板上。 將細胞與差異物連接12 h，測試差異粘附后的細胞。建立空白對照組，正常對照組和單獨的測試組1 和2（濃度為1.6，8，40，200，1 000 μg/mL）； 溫育24 h 后，棄去上清液，向各孔中加入0.75 g/L 中性紅試劑500 μL。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min 后，棄去上清液并用PBS 小心沖洗3 次。加入500 μL 醋酸與乙醇混合液 （1 mol/L 醋酸∶無水乙醇=1∶1），孵育2 h，540 nm 檢測吸光度[9]。

2.9 試驗化合物對腹膜巨噬細胞上清液和LPS共培養(yǎng)物中TNF-α 的影響

將腹膜液細胞的濃度調(diào)節(jié)至2×106/mL， 并將1 mL/孔接種到24 孔板中。 將細胞與差異物連接12 h，測試差異粘附后的細胞。 空白對照組，正常對照組，模型組（LPS100 ng/mL），試驗藥物1 和2給藥組 （濃度1.6，8，40，200，1 000 μg/mL 同時含100 μg/mL LPS）；給藥24 h 后，1 500 r/min×10 min板離心，收集上清，Elisa 檢測TNF-α。 步驟參考試劑說明書：將50 μL 樣品稀釋劑，上清液和檢測抗體在室溫下孵育3 h， 并以300 μL/孔×6 次洗滌板。將細胞與100 μL 辣根過氧化物酶一起在每個孔中孵育45 min。 添加終止溶液， 在450 nm 和570 nm 處進行雙波長檢測[9]。

3 數(shù)據(jù)處理

在3 個平行試驗中測量指標， 并且通過ANOVA（例如DPS 7.05 和Origin 7.5）分析數(shù)據(jù)，用于方差分析，顯著性分析和相關(guān)性分析。

4 結(jié)果與分析

4.1 GLSP1 和GLSP2 對小鼠脾細胞體外增殖的作用

從表1 可以看出，隨著濃度的增加，GLSP1 和GLSP2 可以在一定程度上促進脾細胞的增殖。 當劑量小于200 μg/mL 時， 增殖指數(shù)與結(jié)構(gòu)多糖濃度呈正相關(guān)，2 的作用更明顯。各濃度組GLSP2 的增殖指數(shù)均高于GLSP1，但從表1 可以看出，分別處理靈芝多糖時，分別處理脾細胞。脾細胞的增殖遠低于用ConA 處理的組（5 μg/mL）；當組合施用時，與單獨施用時相比，測試化合物1 和2 在一定程度上刺激脾細胞的增殖。隨濃度增加而增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，但低于ConA 處理組（5 μg/mL），該試驗的結(jié)果表明GLSP1 和GLSP2 均具有促進脾細胞增殖的作用，但與ConA 沒有協(xié)同作用。

4.2 MTT 法檢測小鼠腹腔巨噬細胞的藥物毒性

在測試GLSP1 和GLSP2 對小鼠腹膜巨噬細胞水平的影響時， 有必要確定這兩個樣品是否對BALB/c 小鼠中的腹膜巨噬細胞有毒。 通過MTT測定法測試GLSP1 和GLSP2 在質(zhì)量濃度為8，40，200，1 000 μg/mL 時對小鼠腹腔巨噬細胞存活的影響。從表2 中可以看出，在5 個濃度梯度試驗中，GLSP1 和GLSP2 都不會對細胞產(chǎn)生藥物毒性?？梢钥闯?，GLP 對小鼠腹膜巨噬細胞的活性沒有影響， 并且所用劑量的毒性不影響從隨后的試驗中獲得的結(jié)論（表2）。

表1 GLSP 對脾細胞單獨作用及與刀豆蛋白共同作用對脾細胞增殖指數(shù)的影響Table 1 Effect of GLSP1， GLSP2 on proliferation of spleen cells induced by ConA

表2 受試藥物對BALB/c 小鼠腹腔巨噬細胞毒性作用 （存活率%）Table 2 Effect of GLSP1， GLSP2 on survival rate of PM（%）

4.3 GLSP 對LPS 刺激的PM 增殖的影響

同樣用MTT 法檢測各濃度GLSP 對LPS 刺激后48h 時細胞增殖的抑制率（PI），結(jié)果顯示（圖1）， 質(zhì)量濃度為1.6 ～200 μg/mL 的GLSP1 和GLSP2 均能抑制LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的增殖，并且呈劑量依賴性，其中40～200 μg/mL 的GLSP 的抑制作用已經(jīng)達到了較高的水平，而且由圖1 可以看出，GLSP2 相比于GLSP1 而言，對PM的增殖有著更強的抑制作用。 用MTT 法測定LPS刺激后48 h 細胞增殖的抑制率（PI）。 質(zhì)量濃度為1.6～200 μg/mL 的GLSP1 和GLSP2 抑制LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的增殖。 并且以劑量依賴性方式，40～200 μg/mL 的GLSP 抑制達到高水平。此外，從圖1 中可以看出，GLSP2 對PM 增殖的抑制作用強于GLSP1。

圖1 GLSP 濃度對LPS 誘導的巨噬細胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of GLSP to the cell habitation of PM

全身巨噬細胞具有多種異質(zhì)表型， 在組織穩(wěn)態(tài)，先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮復(fù)雜作用，特別是在宿主防御感染和損傷方面起著重要作用。 由LPS 激活的巨噬細胞是由細胞介導的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)細胞， 具有增強的微生物和腫瘤殺傷能力，并分泌高水平的促炎細胞因子和介質(zhì)。由于細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK-1/2）的激活在巨噬細胞增殖中起關(guān)鍵作用， 其對巨噬細胞增殖的抑制作用可歸因于其對 ERK-1/2 活化的抑制作用[12]。

4.4 試驗藥物對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO 的影響及LPS 誘導NO 釋放的抑制作用

4.4.1 GLSP 刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO 表3 中的結(jié)果表明GLSP1 和GLSP2 可以在小鼠腹膜巨噬細胞中誘導NO 產(chǎn)生， 表明GLSP1 和GLSP2 后小鼠腹膜巨噬細胞的活性增強。 其中，GLSP1 對小鼠腹腔巨噬細胞的激活作用強于GLSP2。 而且GLSP1 和GLSP2 都隨著用量的增加對小鼠腹腔PM 的NO 生成量增加成正相關(guān)，說明均具有劑量依賴性，有著明顯的量效關(guān)系。

表3 受試藥物刺激小鼠腹腔巨噬細胞NO 的生成量（μmol/L）Table 3 Effect of GLSP1， GLSP2 on NO level of PM

4.4.2 抑制LPS 誘導的LPS 釋放PM LPS 是PM中炎癥介質(zhì)的重要刺激因子。 它可以在短時間內(nèi)刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO， 而GLSP1 和GLSP2 可以抑制LPS 誘導的PM 釋放NO。通過減少釋放炎癥介質(zhì)和細胞因子， 吞噬作用和激活特異性免疫的活化巨噬細胞群的數(shù)量， 達到防止免疫應(yīng)答過度的目的。 根據(jù)表4 的結(jié)果，2 號樣品比1 號樣品強。 存在劑量-效應(yīng)關(guān)系并且是劑量依賴性的。 較高濃度的GLSP 抑制LPS 誘導的NO 釋放。

表4 受試藥物對LPS 誘導的PM 的NO 釋放的抑制作用（μmol/L）Table 4 Effect of GLSP1， GLSP2 on NO level of PM after stimulation by LPS

如圖2 所示， 靜息巨噬細胞僅產(chǎn)生少量NO，并且巨噬細胞在LPS 刺激24 h 后合成了大量NO。其質(zhì)量濃度從（0.82±0.14）μg/mL 顯著上升至（8.07±0.42）μg/mL（P＜0.01）；終質(zhì)量濃度為200～1 000 μg/mL 的GLSP2 可顯著抑制LPS 誘導的NO 產(chǎn)生。 GLSP1 還可以抑制NO 的產(chǎn)生，但效果不如GLSP2 明顯。

圖2 不同劑量GLSP 對LPS 誘導的PM 產(chǎn)生NO 的影響Fig.2 Effect of GLSP1， GLSP2 on NO level of PM after stimulation by LPS

NO 是細胞和細胞之間的信使分子，具有極其重要的生理作用。 據(jù)報道， 靈芝多糖可以抑制THP-1 巨噬細胞中誘導型NO 合酶（iNOS）mRNA的表達，抑制NO 的合成。 需要進一步研究GLED在靈芝結(jié)構(gòu)中的作用機理， 可以作為下一步的線索和思路[14]。

4.5 靈芝結(jié)構(gòu)多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

中性紅染料試驗用于檢測GLSP1 和GLSP2對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用的影響。結(jié)果表明，GLSP1 和GLSP2 對小鼠腹膜PM 的直接作用可以促進巨噬細胞吞噬中性紅的能力。 然而， 隨著GLSP 濃度的增加，其對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能的劑量依賴性效應(yīng)降低， 并且測試樣品2 的效果強于測試樣品1 的效果。

表5 受試藥物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（OD=540nm）Table 5 Effect of GLSP1， GLSP2 to Phagocytosis of mouse macrophages （OD=540 nm）

吞噬作用是吞噬細胞如巨噬細胞消除外源病原微生物和內(nèi)源性衰老和死細胞的重要手段。LPS刺激可以增強單核細胞-巨噬細胞的吞噬能力，但也可能導致吞噬細胞的過度活化，導致炎性疾病。在這項研究中， 中性紅染料方法被用來評估巨噬細胞的吞噬作用。 此外，GLSP2 的吞噬作用強于GLSP1，GLSP1 可以保護炎癥灶的正常組織[15]。 然而，GLSP 下調(diào)巨噬細胞吞噬能力的具體機制還有待進一步研究。

4.6 靈芝結(jié)構(gòu)多糖對腹腔巨噬細胞與LPS 共培養(yǎng)上清液TNF-α 的影響

4.6.1 GLSP 直接作用腹腔巨噬細胞對TNF-α 的影響 從表6 中可以看出， 具有不同濃度梯度的GLSP 可以促進腹膜巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α。這表明GLSP 有激活產(chǎn)生這種炎癥因子的細胞的作用。GLSP1 對PM 產(chǎn)生TNF-α 的影響：隨著GLSP1 濃度的增加，TNF-α 的量也增加， 但40 μg/mL 后的效果趨于平緩。 GLSP2 對巨噬細胞的作用也是相同的。

表6 受試化合物對腹腔巨噬細胞上清液TNF-α 的影響 （x±s，n=3）（ng/L）Table 6 Effect of GLSP1， GLSP2 on TNF-α level of PM in mice （x±s，n=3）（ng/L）

表7 受試化合物對腹腔巨噬細胞與LPS 共培養(yǎng)上清液TNF-α 的影響 （x±s，n=3）（ng/L）Table 7 Effect of GLSP1， GLSP2 on TNF-α level of PM after stimulation by LPS （x±s，n=3）（ng/L）

4.6.2 GLSP 對LPS 誘導的PM 的TNF-α 釋放的抑制作用 從圖3 中可以看出，GLSP2 可顯著抑制LPS 誘導的TNF-α 細胞因子的合成， 而不影響細胞活力。 因此，GLSP2 可有效改善BALB/c 小鼠腹腔巨噬細胞LPS 的誘導。 然而，基本上沒有劑量依賴性和劑量-效應(yīng)關(guān)系。 GLSP1 對LPS 誘導的TNF-α 細胞因子的合成沒有抑制作用。

在PM 釋放的許多細胞因子中，TNF-α 作為早期促炎細胞因子引起了很多關(guān)注。 直接介導組織炎癥損傷，促進其他細胞因子的釋放，并介導炎癥反應(yīng)的鏈擴增作用。 越來越多的研究表明，在炎癥反應(yīng)中，TNF-α 刺激介導補體瀑布效應(yīng)的其他細胞因子的產(chǎn)生。 激活中性粒細胞，淋巴細胞，巨噬細胞，刺激PM 產(chǎn)生過氧化物，誘導其他細胞因子的釋放。是一種極為關(guān)鍵的炎癥啟動因子[16]。在該試驗中， 可以看出GLSP2 對LPS 誘導的PM 產(chǎn)生的TNF-α 的量的抑制具有顯著影響。

圖3 不同劑量GLS P 對LPS 誘導的PM產(chǎn)生TNF-α 的影響Fig.3 Effect of GLSP1， GLSP2 on TNF-α level of PM after stimulation by LPS

5 結(jié)論

靈芝結(jié)構(gòu)多糖GLSP1 和GLSP2 作為一種新型天然藥物單體， 可以抑制LPS 誘導的巨噬細胞增殖。 它減弱了其吞噬功能并下調(diào)LPS 激活的巨噬細胞產(chǎn)生的NO 和TNF-α 的水平。 特別是GLSP2 的功能更加顯著， 其對巨噬細胞的重要行為和功能的調(diào)節(jié)充分證明了其作為調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答的藥物的潛力。 它可能成為腫瘤、感染、自身免疫疾病和免疫缺陷疾病等疾病的輔助治療。 它的作用和涉及的具體分子機制是錯綜復(fù)雜的， 靈芝結(jié)構(gòu)多糖具體的構(gòu)效關(guān)系尚待更深入的研究和探討。