趙 燕 徐明生 姚 瑤 李建科 王淑珍 汪 雄 王小強(qiáng) 涂勇剛*

（1 南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心 南昌330047 2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330045 3 南開(kāi)大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300350）

腸道系統(tǒng)長(zhǎng)期受到外來(lái)抗原、 微生物和有害物質(zhì)的干擾或侵害， 是保護(hù)并維持機(jī)體內(nèi)免疫平衡的一個(gè)重要屏障。 腸道上皮細(xì)胞（Intestinal epithelial cells，IECs）是腸道系統(tǒng)中的第一道防線，幫助機(jī)體抵御外來(lái)各種損害， 是黏膜表面天然和獲得性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的重要角色。 腸上皮細(xì)胞如長(zhǎng)期受到干擾或侵害， 會(huì)上調(diào)一系列炎性細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及前列腺素的表達(dá)，分泌過(guò)多的促炎細(xì)胞因子， 促使免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體不可控的慢性炎癥[1]。 而長(zhǎng)期的慢性炎癥會(huì)使腸道黏膜通透性增加，腸道組織損傷，黏膜免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常，嚴(yán)重危害機(jī)體健康[2]。

炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）是一類獨(dú)特的慢性復(fù)發(fā)性腸道炎性疾病，為消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病， 包括克羅恩病 （Crohn’s dis ease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）[3]。在過(guò)去的30年，IBD 發(fā)病率在全球均呈上升趨勢(shì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家尤其明顯[4-5]。一般認(rèn)為IBD 由遺傳易感性、外部環(huán)境因素、腸道微生物菌群、免疫反應(yīng)、 破壞黏膜屏障以及炎癥介質(zhì)增多等多因素導(dǎo)致[6-7]。對(duì)IBD 的治療，目前治療策略包括免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇和抗-TNF-α 抗體的使用。然而，這些傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療方法，雖有療效，但有一定的副作用[8]。研發(fā)新型安全具有抗腸炎作用的食源性生物活性物質(zhì)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。溶菌酶[9]、大豆肽[10-11]、氨基酸[12-13]、植物提取物[14-15]等食源性組分均被證明具有抗腸道炎癥作用。

皮蛋是我國(guó)獨(dú)創(chuàng)的大宗傳統(tǒng)蛋制品， 加工歷史已有600 余年，因其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、色澤美觀而深受消費(fèi)者喜愛(ài)， 是目前市場(chǎng)上主要的蛋制品品種。中醫(yī)古籍《醫(yī)林纂要探源》記載皮蛋“瀉肺熱、醒酒、去大腸火、治瀉痢。 能散、能斂”。 生活中， 人們也一直把皮蛋作為一種良好的清熱去火食品， 在咽喉疼痛、 便秘等上火時(shí)常選擇食用皮蛋。 目前對(duì)其“清熱去火”功效的相關(guān)研究卻未見(jiàn)學(xué)術(shù)報(bào)道。以“去大腸火”為導(dǎo)向，運(yùn)用現(xiàn)代試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃图夹g(shù)手段研究皮蛋蛋白水提物的體內(nèi)、 外抗腸炎活性， 以期為皮蛋的進(jìn)一步推廣和高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋，南昌縣塘南鎮(zhèn)蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)；紅茶，江西云林茶業(yè)有限公司；食鹽，江西省鹽業(yè)集團(tuán)公司；氫氧化鈉（食用級(jí)），天津市津華化工廠；硫酸銅（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清（FBS）、 盤(pán)尼西林-鏈霉素，Gibco 公司；TNF-α、Mouse anti -human IL -8 antibody、Biotinylated mouse anti-human IL-8 antibody、IL-8 標(biāo)準(zhǔn)品、過(guò)氧化物酶標(biāo)記（Av-HRP）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、TNF-α 檢測(cè)試劑盒、IL-6 檢測(cè)試劑盒，BD Bioscience 公司；吐溫-20，F(xiàn)isher 公司；水溶性四唑鹽 （WST-1），Roche 公司；Bio-Rad DC、Aurum Total RNA Mini Kit、iQ SYBR Green Supermix、iScript cDNA 合成試劑盒，Bio-Rad 公司；葡聚糖硫酸鈉（DSS），MP Biomedicals 公司；人的腸道細(xì)胞Caco-2，中科院細(xì)胞庫(kù)；雌性Balb/c 小鼠，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱， 美國(guó)Thermo 公司；NanoDrop ND-1000，Thermo Scientific 公司；RT-PCR儀（MyiQ series），Bio-Rad 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板，Corning Costar 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 皮蛋的腌制 將3%茶葉水煮沸，倒入配料缸中冷卻， 然后緩慢加入0.4%硫酸銅、4%食鹽與4.5%氫氧化鈉，并不斷攪拌，冷卻至常溫備用。 將直接購(gòu)于養(yǎng)殖場(chǎng)的新鮮鴨蛋洗凈晾干， 驗(yàn)收后將其依次碼放在洗凈的腌制缸中， 加入配制好的料液，然后用塑料膜封蓋，并在上面添置一定量水壓好，25℃恒溫腌制約35d 后取出，常溫保存。

1.3.2 皮蛋蛋白水提物的制備 取皮蛋蛋白，按1∶2 加入超純水， 高速勻漿處理后振蕩30 min，然后用紗布過(guò)濾， 過(guò)濾液在4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.22 μm 膜過(guò)濾，然后采用美國(guó)Spectra100 Da 透析膜除鹽與氨基酸，半天換水一次，連續(xù)透析2 d，冷凍干燥獲得皮蛋蛋白水溶性提取物。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液中， 加入20% FBS 和50 units/mL 盤(pán)尼西林-鏈霉素，并在5% CO2和37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，本試驗(yàn)中使用細(xì)胞代數(shù)為20～50 代。 細(xì)胞接種后培養(yǎng)6～7 d 直到達(dá)到細(xì)胞融合，每隔2～3 d 換一次新鮮的培養(yǎng)液。

1.3.4 樣品抑制TNF-α 誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞炎癥反應(yīng) 將培養(yǎng)好的Caco-2 細(xì)胞接種到48 孔板（1×105細(xì)胞/孔）上培養(yǎng)5～7 d，待細(xì)胞融合80%～90%時(shí)吸除培養(yǎng)基，并采用HBSS 清洗1 次，然后加入采用含有不同濃度樣品的細(xì)胞培養(yǎng)基 （含5%FBS）進(jìn)行培養(yǎng)，2 h 后加入2 ng/mL TNF-α 誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)，4 h 后收集上清液測(cè)定IL-8。

1.3.5 樣品細(xì)胞毒性研究 采用水溶性四唑鹽試劑（WST-1）測(cè)定。處理完的細(xì)胞將上清液（即培養(yǎng)基）去除，每孔加入200 μL 與培養(yǎng)基體積比為1∶30 的WST-1 溶液，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～15 min，每隔5 min 查看顏色變化，待顏色變?yōu)闇\橙色在450 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.3.6 IL-8 的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定。 將Purified mouse anti-human IL-8 monoclonal antibody 用pH 9.0 0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液稀釋（1∶1 000，V/V），后分別加入100 μL 至96 孔板中，置于4 ℃過(guò)夜。 用磷酸鹽緩沖液 （PBS）-0.05%Tween-20（PBST）洗滌4 次，加入200 μL/孔的1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 溶液，在37 ℃條件下孵育1 h，用PBST 溶液洗滌4 次。 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品采用1%的PBST 溶液稀釋5 倍， 向96 孔板中加入100 μL/孔的稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，然后置于37 ℃條件下孵育2 h，用PBST 溶液洗滌4 次。 將Biotinylated mouse anti-human IL-8 antibody 稀釋2 000 倍，加入100 μL/孔，然后于37 ℃條件下孵育1 h， 洗滌4 次后， 加入稀釋2 000 倍的Av-HRP 酶100 μL/孔，37 ℃條件下孵育30 min，洗滌4 次，最后加25 μL/孔TMB 酶作用溶液，于常溫或37 ℃黑暗處顯色， 直到顏色變?yōu)闇\藍(lán)色， 用1 N H2SO4終止反應(yīng)，并于450 nm 測(cè)定吸光度值。樣品中IL-8 的濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。

1.3.7 細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的測(cè)定 將細(xì)胞置于24 孔板中培養(yǎng)后加入樣品抑制炎性反應(yīng)，抽提細(xì)胞培養(yǎng)體系總RNA 逆轉(zhuǎn)錄后使用RT-PCR 檢測(cè)。 采用Fast 200 試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后取RNA 200～300 ng 在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下用OligdT 引物合成待測(cè)細(xì)胞因子cDNA。 在含有1 mmol/L MgCl2和1U Taq DNA 聚合酶的RT-PCR SYBR Green 反應(yīng)體系中反應(yīng)。內(nèi)參選用GAPDH，引物序列見(jiàn)表1。 PCR 循環(huán)參數(shù)為：95 ℃15s 變性，56 ℃15s 退火，72 ℃30 s 延伸。 PCR 擴(kuò)增曲線由RT-PCR 儀獲得各目的分子CT 值，由2-△△CT法計(jì)算出RQ 值， 代表細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)水平[16]。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Sequence of primers in RT-PCR

1.3.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取BALB/c 雌性小鼠，6～8 周左右，體重 （20.0±2.0）g。 所有小鼠飼養(yǎng)于塑料鼠籠中，可以自由飲用水和基本膳食。保持溫度（25±0.5）℃，相對(duì)濕度50%±5%，并執(zhí)行12 h/12 h的燈光/黑暗循環(huán)。小鼠在購(gòu)買(mǎi)飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，并給所有組小鼠提供相同的基本膳食。 飼養(yǎng)第7 天開(kāi)始，小鼠連續(xù)7 d 經(jīng)飲用水服用5% DSS 致急性結(jié)腸炎， 結(jié)束后致死小鼠[17]。將小鼠的結(jié)腸移除并測(cè)定結(jié)腸的長(zhǎng)度。移除大約10%遠(yuǎn)端結(jié)腸并保存于福爾馬林溶液中，用于組織學(xué)觀察；部分小鼠結(jié)腸組織放入離心管中，快速冷凍，用于細(xì)胞因子的測(cè)定；部分小鼠結(jié)腸組織放入RNAlater 中，用于基因表達(dá)分析。 試驗(yàn)分組如下：空白組，全程飲用不含DSS 滅菌水+灌胃0.2 mL 生理鹽水； 陽(yáng)性對(duì)照組，1～7 d 飲用不含DSS 滅菌水，8～14 d 飲用含5% DSS 滅菌水，全程灌胃0.2 mL 生理鹽水；低濃度組，1～7 d 飲用不含DSS 滅菌水，8～14 d 飲用含5% DSS 滅菌水，全程灌胃0.2 mL 皮蛋蛋白水提物溶液（150 mg/kg）；高濃度組，1～7 d 飲用不含DSS 滅菌水，8～14 d 飲用含5% DSS 滅菌水，全程灌胃0.2 mL 皮蛋蛋白水提物溶液（300 mg/kg）。

1.3.9 體重變化與結(jié)腸損傷評(píng)價(jià) 確定和評(píng)價(jià)小鼠的3 個(gè)主要結(jié)腸炎表征：體重變化、糞便黏稠度（包括腹瀉記錄）和糞便便血。 結(jié)腸損傷通過(guò)糞便黏稠度和糞便便血進(jìn)行評(píng)估。 對(duì)糞便黏稠度，0 分表示正常并狀態(tài)良好的糞便，1.5 分是呈糊狀的糞便，而3 分表示的是糞便液化并黏在肛門(mén)上。 對(duì)糞便便血，0 分表示沒(méi)有糞便便血，1.5 分是有糞便便血，3 分是便血嚴(yán)重[18]。

1.3.10 結(jié)腸組織學(xué)分析 對(duì)組織進(jìn)行固定，石蠟切片和蘇木精伊紅染色。 同時(shí)按以下指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，嚴(yán)重程度越高，評(píng)分越高：炎癥（0～3），隱窩損傷（0～3）和滲透程度（0～3）。 三項(xiàng)相加，總分在0～9范圍內(nèi)[18]。

1.3.11 結(jié)腸炎性細(xì)胞因子的測(cè)定 將100 μg 的樣品組織， 加入4 倍體積的含有0.5% Triton X-100 和蛋白酶抑制劑 （10 μg/mL aprotinin、leupeptin、pepstatin 和 1 mmol/L phenylmethanesulfonylfluoride）的PBS 緩沖液，高速勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，DC Protein Assay 法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量， 采用ELISA 試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-6 濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析（Duncan 新復(fù)極差多重比較法），P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮蛋蛋白水提物體外抗腸炎作用

Caco-2 細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞的一種，已成為研究腸道炎癥的穩(wěn)定體外模型系統(tǒng)，其在TNF-α 誘導(dǎo)下會(huì)分泌大量的促炎細(xì)胞因子IL-8[19-20]。如圖1所示，正常Caco-2 細(xì)胞中IL-8 的含量極低，但在TNF-α 刺激4 h 后IL-8 的分泌量從（204.66±8.88）pg/mL 上升到（2 450.38±105.52）pg/mL，說(shuō)明建立體外炎癥模型成功。 以此模型考察了濃度分別為0.1，0.5，1，5，10 mg/mL 的皮蛋蛋白水提物抑制炎癥作用， 結(jié)果表明各添加濃度均未對(duì)Ca co-2 細(xì)胞產(chǎn)生毒性，在高濃度的情況下（5 和10 mg/mL）皮蛋蛋白水提物呈現(xiàn)出一定的體外抗腸炎作用（P<0.05）。

在該細(xì)胞模型條件下， 進(jìn)一步考查了皮蛋蛋白水提物對(duì)細(xì)胞抑炎細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響。 結(jié)果表明添加皮蛋蛋白水提物（10 mg/mL）處理后可明顯下調(diào)Caco-2 細(xì)胞IL-8、TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎細(xì)胞炎癥的基因表達(dá)量。 同時(shí)，皮蛋蛋白水提物可上調(diào)Caco-2 細(xì)胞抑炎細(xì)胞因子IL-10 的基因表達(dá)量。

圖1 皮蛋蛋白水提物在TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型中的抗炎作用Fig.1 Anti-inflammatory effect of water extract of preserved egg white in TNF-α induced Caco-2 cell inflammation model

圖2 皮蛋蛋白水提物在TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞炎癥模型中調(diào)節(jié)mRNA 表達(dá)的作用Fig.2 Effects of water extract of preserved egg white on the mRNA expressions in TNF-α induced Caco-2 cell inflammation model

2.2 皮蛋蛋白水提物體內(nèi)抗腸炎作用

2.2.1 皮蛋蛋白水提物對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠臨床癥狀的影響 DSS 可損傷小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，破壞腸屏障完整性， 并激活促炎細(xì)胞因子的分泌和基因表達(dá)，導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)腸炎，是典型可靠的體內(nèi)結(jié)腸炎模型[21-22]。本研究采用此模型考察了皮蛋蛋白水提物在體內(nèi)的抗炎活性。對(duì)比空白對(duì)照組，從DSS 處理后第6 天始陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的體重開(kāi)始顯著降低（P<0.05）。 然而在第7 天，皮蛋蛋白水提物低劑量和高劑量試驗(yàn)組小鼠體重降低的程度與陽(yáng)性對(duì)照組均有了顯著性差異（P<0.05），表明皮蛋蛋白水提物可以緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎造成的小鼠體重下降（圖3a）。

DSS 誘導(dǎo)5d 后小鼠出現(xiàn)明顯的結(jié)腸炎臨床癥狀，如腹瀉、直腸出血和嗜睡，灌胃皮蛋蛋白水提物后，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，第5 天后高濃度組和低濃度組腹瀉和出血等臨床癥狀均明顯減輕（P<0.05）（圖3b）。

本試驗(yàn)中， 采用DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組其結(jié)腸長(zhǎng)度為（5.34±0.24）cm，而未經(jīng)誘導(dǎo)的空白組為（7.01±0.31）cm，可見(jiàn)DSS 誘導(dǎo)后可明顯導(dǎo)致小鼠結(jié)腸受損，使其長(zhǎng)度變短。在經(jīng)過(guò)皮蛋蛋白水提物干預(yù)后， 高濃度和低濃度組均可有效縮短結(jié)腸的縮短程度（P<0.05）（圖3c）。

圖3 皮蛋蛋白水提物對(duì)DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎臨床癥狀的影響Fig.3 Effects of water extract of preserved egg white on clinical signs in DSS-induced colitic mice

2.2.2 皮蛋蛋白水提物對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)的影響 圖4 是通過(guò)蘇木精-伊紅染色后的結(jié)腸組織學(xué)觀察結(jié)果。 由圖可以看出空白組小鼠結(jié)腸組織學(xué)正常并擁有正常的隱窩結(jié)構(gòu)。 然而，DSS 結(jié)腸炎組小鼠固有層和黏膜下層的細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)。 高濃度和低濃度樣品組均能減少結(jié)腸黏膜，黏膜下層和固有肌層的破壞。組織學(xué)形態(tài)評(píng)分結(jié)果表明DSS 結(jié)腸炎組其組織學(xué)分?jǐn)?shù)為14.78±1.55，而經(jīng)過(guò)皮蛋蛋白水提物干預(yù)后的結(jié)腸炎小鼠的組織學(xué)分?jǐn)?shù)顯著低于DSS 組， 分別為10.89±1.06 和7.31±0.36， 濃度越高減緩結(jié)腸炎小鼠的組織學(xué)變化效果越好。

圖4 皮蛋蛋白水提物對(duì)結(jié)腸組織學(xué)的影響Fig.4 Effects of water extract of preserved egg white on colon histology

2.2.3 皮蛋蛋白水提物對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠促炎細(xì)胞因子分泌量的影響 各組小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 濃度分析結(jié)果如圖4 所示。 由圖可知，DSS 誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸組中分泌了大量的促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6， 分別由（18.65±2.99）pg/mg 蛋白質(zhì)、（8.03±1.38）pg/mg 蛋白質(zhì)上升到 （42.31±5.76）pg/mg 蛋白質(zhì)、（22.46±1.67）pg/mg 蛋白質(zhì)， 但在高濃度和低濃度皮蛋蛋白水提物干預(yù)后其分泌量均顯著下降（P<0.05）。

圖5 皮蛋蛋白水提物對(duì)結(jié)腸組織TNF-α （a）和IL-6 （b）含量的影響Fig.5 Effects of water extract of preserved egg white on the concentration of TNF-α （a）and IL-6 （b）in colon

2.2.4 皮蛋蛋白水提物對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠促炎和抑炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響 皮蛋蛋白水提物對(duì)小鼠結(jié)腸促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。 如圖所示，與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠比較，灌胃150 mg/kg 和300 mg/kg 皮蛋蛋白水提物均能不同程度降低促炎細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17A 等基因的表達(dá)（P<0.05）， 同時(shí)對(duì)抑炎細(xì)胞因子IL-10的基因表達(dá)有一定的促進(jìn)作用（P<0.05）。

3 討論

禽蛋蛋清中90%以上固形物為蛋白質(zhì)， 且種類達(dá)一百余種，其中富含卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶等多種蛋白質(zhì)[23]。皮蛋由氫氧化鈉、氯化鈉、茶葉、硫酸銅或硫酸鋅等作用下腌制而成， 其中起主要作用的為氫氧化鈉[24]。 在強(qiáng)堿的誘導(dǎo)下，禽蛋蛋清形成了主要由離子鍵和二硫鍵作用的高彈性低硬度凝膠體。 本實(shí)驗(yàn)室研究已證實(shí)在皮蛋腌制過(guò)程中， 除了溶菌酶較為穩(wěn)定以外，卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白等其它高含量蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿的作用下均發(fā)生了明顯的降解， 多肽和游離氨基酸含量逐漸升高，因此水溶性組分增多[25-26]。 本研究首次證明皮蛋蛋白水溶性提取物在體內(nèi)和體外均有一定抗腸道炎癥作用。 已有多種蛋源性肽被證實(shí)具有一定抗炎活性， 如從雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物中分離出的三肽IRW 和IQW 能夠有效地降低促炎細(xì)胞因子的釋放、調(diào)節(jié)NF-κB 炎癥信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)[27]；Shi 等[28]研究發(fā)現(xiàn)雞蛋膜蛋白酶解物可在腸道細(xì)胞炎癥模型中通過(guò)抑制NF-κB 的激活，下調(diào)促炎細(xì)胞因子和上調(diào)抗炎細(xì)胞因子，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，起到抗炎作用；卵黃高磷蛋白肽PPPs 在TNF-α/LPS 誘導(dǎo)的HT-29/Caco-2/RAW 264.7 等細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中均能顯著抑制一些主要促炎癥因子的基因表達(dá)， 從而起到抗炎癥作用[20]。 因此，我們推測(cè)肽可能是皮蛋蛋白水溶性提取物具有抗炎作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)， 我們運(yùn)用超濾技術(shù)獲得了皮蛋蛋白水溶性提取物、仿生酶解產(chǎn)物≤5ku 的肽段， 并通過(guò)細(xì)胞炎癥模型證實(shí)其具有較好的抗炎作用。

圖6 皮蛋蛋白水提物對(duì)結(jié)腸組織促炎和抑炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of water extract of preserved egg white on gene expression of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in colon

由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNF-α 在急性炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)其它促炎細(xì)胞因子的分泌中起著重要的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)5 和10 mg/mL 的皮蛋蛋白水溶性提取物均可以降低TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中促炎細(xì)胞因子IL-8 的分泌量，同時(shí)可下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、IL-6 和IL-1β 基因的表達(dá)， 說(shuō)明皮蛋水溶性提取物在炎癥的早期具有一定干預(yù)作用。 在TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，IL-8 促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的下調(diào)與NF-κB炎癥通路受到抑制有關(guān)， 此機(jī)制與小鼠體內(nèi)抗炎作用類似[29]。 因此，我們進(jìn)一步研究了皮蛋水溶性提取物對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的抗炎作用。DSS 的攝入可導(dǎo)致小鼠體重下降、 腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、黏膜潰瘍、嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)腸縮短、腹瀉、便血等潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。 但是，我們發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)的濃度條件下， 皮蛋水溶性提取物均能減緩DSS 誘導(dǎo)的各種結(jié)腸炎臨床癥狀[21-22]，并能抑制促炎細(xì)胞因子的分泌和基因的表達(dá)。 皮蛋水溶性提取物減緩結(jié)腸炎的臨床癥狀作用與大豆肽、蛋源性肽和蛋白質(zhì)等較為類似[10，28，30]，但對(duì)細(xì)胞因子的抑制作用有一定差別， 提示各種活性組分的抑制結(jié)腸炎的通路可能不一樣。

細(xì)胞因子在IBD 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。 細(xì)胞因子可以激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞， 導(dǎo)致免疫特異表達(dá)反應(yīng)和慢性炎癥[31]。 在DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸模型和IBD 患者中，TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、MCP-1 等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)均有所上調(diào)[8，18]。TNF-α 和IL-6是參與黏膜炎癥發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子， 包括激活I(lǐng)BD 患者的巨噬細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞[32]。IFN-γ 參與腸道炎癥的持續(xù)， 從而增加炎性腸病的嚴(yán)重程度[33]。 IL-1β 由ROS 激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在IBD 發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[34]。MCP-1 在IBD慢性炎癥中參與免疫細(xì)胞從血液中到黏膜和黏膜下層的滲透[35]。 IL-17A 是由T 淋巴細(xì)胞中Th17所產(chǎn)生，Th17 細(xì)胞與其分泌的細(xì)胞因子的增加和IBD 的嚴(yán)重程度有關(guān)[36]。 各細(xì)胞因子之間相互影響，IL-1β 和IL-6 涉及Th17 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，進(jìn)而加速I(mǎi)L-17A 的分泌與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[37]。 本研究表明， 皮蛋蛋白水提物可顯著下調(diào)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、MCP-1等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)， 說(shuō)明皮蛋蛋白水提物可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)揮抗炎作用。

總之， 本研究表明皮蛋蛋白水提物可抑制腸道細(xì)胞或組織促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生， 并可通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)減緩DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎炎癥程度。 下一步研究的重點(diǎn)將是快速篩選得到皮蛋蛋白水提物中的單體抗腸炎肽， 并從體內(nèi)外闡明其分子作用機(jī)制。 腸道慢性炎癥嚴(yán)重影響人體健康，而傳統(tǒng)治療炎癥藥物均有一定副作用，皮蛋蛋白源性抗炎肽有望為機(jī)體炎性反應(yīng)提供新的抗炎策略。