鄧秋林，楊正明，陳 雨，張亞琴，雷飛益，李思佳，劉震東，陳興福

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，成都 611130;2.四川新荷花川貝母生態(tài)藥材有限公司，四川松潘 623301)

瓦布貝母[FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen]為百合科貝母屬植物，是川產(chǎn)道地藥材川貝母的基源植物之一。瓦布貝母以鱗莖入藥，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰的功效，用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、痰中帶血、瘰疬、乳癰、肺癰等癥[1]。瓦布貝母主要分布于四川岷江上游山區(qū)的茂縣、北川、松潘、黑水縣境內(nèi)，生長在海拔2500～3000m的灌木林、小喬木林下[2]。川貝母由于生境特殊、生長年限長、野生資源過度采挖等原因而日趨瀕危[3]，然而川貝母的用量逐年增加，川貝母的人工栽培尤為重要。瓦布貝母易成活、產(chǎn)量高且質(zhì)優(yōu)，其引種栽培成功緩解了川貝藥用資源緊張的問題，同時為促進川貝母野生資源的保護提供了保證。川貝母人工栽培雖然取得了一定的成果，但川貝母的資源量仍然不足，人工栽培技術(shù)的研究仍需要加強，以求達到高產(chǎn)和高效[2,4]，從而解決川貝藥用資源短缺的問題。合理施肥有利于提高藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量[5]。氮磷鉀的施用會改善藥用植物的性狀，從而影響其產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。川貝母中含有多種化學成分，包括生物堿類和非生物堿類，其中生物堿是川貝母的特征成分，也是主要活性成分，常作為貝母類藥物的指標成分[7]。張禮等[8]研究表明施肥水平是影響川貝母燈籠花期產(chǎn)量的主要因素；鄧孔權(quán)[9]研究施肥對川貝母田間產(chǎn)量的影響結(jié)果表明，田間施用氮磷鉀復合肥(氮磷鉀為13∶5∶7)的增產(chǎn)效果可達到70%以上。夏進春等[10]研究結(jié)果表明氮磷鉀肥的混合施用比單獨施用效果好。馬靖[11]通過“3414”田間試驗表明，川貝母的需肥量小，5a年生川貝母的最佳施肥方案為氮肥10.91kg/hm2、磷肥0kg/hm2、鉀肥26.85kg/hm2。劉洪見等[12]研究表明，氮肥、鉀肥對浙貝母所起的增產(chǎn)效益并不顯著，磷肥對其有極顯著的增產(chǎn)效應。前人對瓦布貝母的研究主要集中資源分類[13-16]、化學成分[17-20]和藥理作用[21-24]等方面，對其栽培技術(shù)的研究鮮有報道，生產(chǎn)上也鮮有合理的氮磷鉀配施量。不同藥材對氮磷鉀的需求量及其比例不一樣，氮磷鉀對藥材產(chǎn)量和藥用成分含量的影響也各不相同[23-27]。本試驗采用三因素五水平二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，研究不同氮磷鉀配施對瓦布貝母鱗莖產(chǎn)量及總生物堿質(zhì)量分數(shù)的影響，明確瓦布貝母高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的氮磷鉀配施量，為瓦布貝母合理施肥和提高肥料利用率提供科學依據(jù)，從而提高栽培瓦布貝母的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花中藥飲片股份有限公司川貝母標準化生產(chǎn)基地(32°19′N，103°49′E)進行，年均氣溫11.0 ℃，無霜期 215.4 d，年均日照1 549.4 h。。試驗地基本養(yǎng)分狀況：pH 5.7，有機質(zhì)53.57 g/kg，堿解氮490.06 mg/kg，有效磷105.11 mg/kg，速效鉀168.55 mg/kg。

1.2 試驗材料

試驗材料為5 a生瓦布貝母栽培品種，由四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花中藥飲片股份有限公司川貝母標準化生產(chǎn)基地提供，試驗材料經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學陳興福教授鑒定為百合科貝母屬植物瓦布貝母(F.unibracteatavar.wabuensis)。供試肥料為尿素(總N≥46%，甘肅劉化(集團)有限責任公司)、過磷酸鈣(P2O5≥12%，四川省成都市青白江區(qū)磷肥廠)、硫酸鉀(K2O≥60%，國投新疆羅布泊鉀鹽有限責任公司)。

1.3 試驗設(shè)計

試驗采用三因素五水平二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，設(shè)置氮肥、磷肥、鉀肥3個因素、5個水平 (表1)，共20個處理(表2)。各小區(qū)隨機安排于試驗地中。瓦布貝母于2016年8月栽種，小區(qū)面積1.5 m2(1.5 m×1.0 m)，株距10 cm、行距 15 cm，每個小區(qū)栽種貝母90粒，并稱量，在栽培前施用15 000 kg/hm2的農(nóng)家肥作為底肥。后期，除肥料施用外，其他處理與基地管理一致。氮肥、磷肥和鉀肥均做追肥施用，分別在瓦布貝母齊苗期、開花期和掛果期施用，用量為總量的20%、40%和40%，施用時與小區(qū)土壤混勻后撒施。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table kg/hm2

0

表2 試驗設(shè)計與實施方案Table 2 Experimental design and implementation plan g/m2

1.4 測定項目與方法

1.4.1 瓦布貝母產(chǎn)量 2017-08-06在瓦布貝母植株地上部分完全倒苗后進行采挖，分別按照試驗小區(qū)的編號測定產(chǎn)量，并折算成單位面積產(chǎn)量，再與播種下去的鱗莖質(zhì)量計算鱗莖増重率。

增重率=(采收時的鱗莖質(zhì)量-播種時的鱗莖質(zhì)量)/播種時的鱗莖質(zhì)量×100%。

1.4.2 瓦布貝母總生物堿 精密稱取西貝母堿對照品3.3 mg，用三氯甲烷溶液定容至25 mL容量瓶中。精密吸取標準溶液0、0.l、0.2、0.4、 0.6、1.0 mL，置于具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10.0 mL，精密加入5 mL水、2 mL 0.05%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.05 g，用0.2 moL/L氫氧化鈉溶液6 mL使溶解，加磷酸二氫鉀1 g，加水使溶解并稀釋至100 mL，即得)，劇烈振搖1 min，分液放置30 min。取三氯甲烷層液，用干燥濾紙過濾，取續(xù)濾液，用紫外分光光度計測定415 nm波長下的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。參照2015版《藥典》[1]中的方法，略加改進，即取瓦布貝母粉末約1 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加濃氨試液1.5 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(體積比4∶1)混合溶液20 mL，置80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，過濾，濾液置50 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇(體積比4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(體積比 4∶1)混合溶液至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解，照標準曲線的制備方法，自“精密加入5 mL水”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中西貝母堿的質(zhì)量(mg)，計算，即得。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel 2016和DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對文中數(shù)據(jù)進行方差分析，三元二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計原理建立數(shù)學模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學模型的建立與檢驗

根據(jù)測得鱗莖增重率和總生物堿質(zhì)量分數(shù)數(shù)據(jù)，通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法進行統(tǒng)計，見表3。

對上述方程進行失擬性檢驗，計算結(jié)果見表4。由表4可知，對Y1、Y2回歸方程進行方差分析，Y1回歸方程在F檢驗中，F(xiàn)R達到極顯著水平，F(xiàn)Lf不顯著，表明該回歸方程擬合度合理可靠，用其來預測增重率的數(shù)學模型可靠程度高。Y2回歸方程在F檢驗中，F(xiàn)R達到顯著水平，F(xiàn)Lf不顯著，表明該回歸方程擬合度較好，該數(shù)學模型成立。

2.2 模型分析

2.2.1 主效應分析 一次項回歸系數(shù)絕對值的大小可以直接比較各因素對瓦布貝母增重率和總生物堿質(zhì)量分數(shù)的影響，試驗中各因素對增重率影響的大小順序為：磷肥(X2)>氮肥(X1)>鉀肥(X3)，試驗中各因素對總生物堿質(zhì)量分數(shù)影響的大小順序為：氮肥(X1)>鉀肥(X3)>磷肥(X2)。

根據(jù)方程得出Y1(增重率)單因素回歸方程效應影響圖1，由圖1可以看出，磷肥對瓦布貝母增重率影響呈先上升后下降的趨勢。在 -1.682水平到0水平之間，隨著磷肥用量的增加，增重率增加，在0水平達到最大，之后，隨著施肥水平的增加，增重率減少。

表3 試驗設(shè)計結(jié)構(gòu)矩陣和試驗結(jié)果Table 3 Experimental design structure matrix and test results

表4 試驗結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of test results

注：*為差異顯著(P<0.05)，**為差異極顯著(P<0.01)。

Note：* show significant different(P<0.05)；** show extremely significant different(P<0.01).

根據(jù)方程得出Y2(總生物堿)回歸方程效應影響圖2。由圖2可以看出，各因素對瓦布貝母總生物堿影響整體趨勢呈先上升后下降。在 -1.682水平到0水平之間，隨著施肥水平的增加，總生物堿質(zhì)量分數(shù)增加，在0水平達到最大，之后，隨著施肥水平的增加，總生物堿質(zhì)量分數(shù) 減少。

圖1Y1(增量率)單因素效應分析Fig.1Y1 (mass gain rate) single factor analysis

圖2 Y2(總生物堿質(zhì)量分數(shù))單因素效應分析Fig.2 Y2 (total alkaloid mass fraction) single factor analysis

2.2.3 互作效應分析 由表4可知，X2X3對瓦布貝母增重率影響顯著，X1X2和X1X3未達到顯著；X1X3對瓦布貝母總生物堿質(zhì)量分數(shù)的影響顯著，X1X2和X2X3未達到顯著。

由此方程可以計算出鉀肥與磷肥的互作效應圖3。由圖3可以看出，不同水平磷肥、鉀肥均影響瓦布貝母增重率的提高，磷肥和鉀肥的互作效應有利于增重率的提高。在-1.682水平到-1水平l鉀肥和1水平到1.682水平磷肥有利于增重率的提高，磷肥為1水平，鉀肥為-1.682水平時，瓦布貝母的增重率達到最大。

由方程得到X1X3互作效應質(zhì)量分數(shù)變化圖4。

圖3 磷、鉀互作對增重率的影響Fig.3 Effects of phosphorus and potassium interaction on weight gain rate

圖4 氮、鉀互作對總生物堿質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effects of nitrogen and potassium interaction on total alkaloid content

由圖4可以看出，不同水平的氮肥、鉀肥均影響瓦布貝母總生物堿的積累，磷肥和鉀肥的互作效應利于總生物堿的積累。在0水平到1水平氮肥和0水平到1水平鉀肥有利于總生物堿的積累，氮肥和磷肥都在0水平時，瓦布貝母的總生物堿質(zhì)量分數(shù)最高。

2.2.4 施肥方案的優(yōu)選 以Y1(增重率)、Y2(總生物堿質(zhì)量分數(shù))方程作為相關(guān)函數(shù)，通過統(tǒng)計頻數(shù)法選優(yōu)分析得出符合相關(guān)目標的氮磷鉀配施 方案。

綜合考慮瓦布貝母的生產(chǎn)潛力以及茂縣松坪溝鄉(xiāng)的土壤狀況，可將瓦布貝母增重率為 105.13%作為高產(chǎn)目標，利用統(tǒng)計頻數(shù)法選優(yōu)，計算試驗處理全部實施時全部的理論產(chǎn)量。通過DPS 7.05軟件分析可知，在組合方案中，產(chǎn)量預測值達到目標要求的有51個，結(jié)果見表5。通過對95%的置信區(qū)間分布進行計算，可優(yōu)化出穩(wěn)定的施肥范圍。當施用氮肥7.79～12.00 kg/hm2、磷肥38.79～49.25 kg/hm2、鉀肥15.39～24.49 kg/hm2時，瓦布貝母增重率大于105.13%。

表5 瓦布貝母增重率≥105.13%的方案頻數(shù)分布Table 5 The program frequency distribution of Fritillaria unibracteata var.wabuensis weight gain rate≥105.13%

《中華人民共和國藥典》[1]中要求，川貝母中總生物堿質(zhì)量分數(shù)不得少于0.05%，根據(jù)《藥典》指標的要求并結(jié)合本試驗結(jié)果，將瓦布貝母中總生物堿質(zhì)量分數(shù)大于0.37%定為高質(zhì)量分數(shù)。在組合方案中，瓦布貝母中總生物堿質(zhì)量分數(shù)大于 0.37%時有41個方案，結(jié)果見表6。通過對95%的置信區(qū)間分布進行計算，可優(yōu)化出穩(wěn)定的施肥范圍。當施用氮肥8.98～12.96 kg/hm2、磷肥 26.63～43.37 kg/hm2、鉀肥17.44～25.40 kg/hm2時，瓦布貝母總生物質(zhì)量分數(shù)大于 0.37%。

綜合考慮增重率和總生物堿質(zhì)量分數(shù)，當施用氮肥8.98.79～12.00 kg/hm2、磷肥38.79～43.37 kg/hm2、鉀肥17.44～24.49 kg/hm2時，可使瓦布貝母增重率大于105.13%，總生物堿質(zhì)量分數(shù)大于0.37%。

表6 瓦布貝母總生物堿質(zhì)量分數(shù)≥0.37%的方案頻數(shù)分布Table 6 Program frequency distribution of Fritillaria unibracteata var.wabuensis total alkaloid mass fraction ≥0.37%

3 討論與結(jié)論

氮磷鉀被稱為“肥料三要素”，過量或缺乏會影響藥用植物的生長發(fā)育，同時，土壤中氮磷鉀的質(zhì)量分數(shù)也影響著藥用植物對這些元素的吸收，從而影響中藥材的品質(zhì)?？茖W合理的施肥有利于藥用植物的生長發(fā)育以及產(chǎn)量質(zhì)量的形成。研究表明[28-29]氮磷鉀合理配施可以促進黃芪的生長和干物質(zhì)的積累，提高黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和總黃酮等活性成分質(zhì)量分數(shù)。本研究結(jié)果表明，在試驗因素范圍內(nèi)氮、磷、鉀均有利于瓦布貝母增重率的提高和總生物堿的積累。試驗中測得的總生物堿質(zhì)量分數(shù)高于張培培等[17]的測定結(jié)果，說明氮磷鉀配施可以提高瓦布貝母總生物堿的質(zhì)量分數(shù)。

大量研究表明氮肥對產(chǎn)量的影響較大[30-32]，本試驗中磷肥對瓦布貝母產(chǎn)量的影響較大，原因可能是氮肥用量較少，增加用量影響較?。涣卓梢源龠M根系的生長發(fā)育。氮肥對生物堿的積累影響較大，可能是因為氮元素是生物堿的組成元素之一，張燕等[33]的研究結(jié)果也說明氮對生物堿的合成有促進作用，但對其作用機制還未有更深入的研究。由互作效應得到的兩因素互作效應可知磷鉀互作影響增重率，氮鉀互作影響瓦布貝母總生物堿的質(zhì)量分數(shù)積累。磷鉀均可以影響植物的生長發(fā)育，鉀的作用只有在磷充足的條件下發(fā)揮出來[34]，鉀可以提高氮肥的效應。

通過二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計，本研究建立氮肥、磷肥、鉀肥與瓦布貝母鱗莖增重率和總生物堿之間的回歸方程。試驗模型結(jié)果表明，氮磷鉀肥配施有利于瓦布貝母增重率和總生物堿質(zhì)量分數(shù)的提高，但是需要適量施用，過量施用會對產(chǎn)量、總生物堿質(zhì)量分數(shù)產(chǎn)生抑制效果。綜合考慮產(chǎn)量與質(zhì)量可以得出施用氮肥8.98～12.00 kg/hm2、磷肥 38.79～43.37kg/hm2、鉀肥17.44～24.49 kg/hm2時，可使瓦布貝母增重率大于105.13%，總生物堿質(zhì)量分數(shù)大于0.37%。