何詩依 李鐵瑛 嚴(yán)露 侯影 張纓

北京體育大學(xué)運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院（北京100084）

Apelin 是血管緊張素Ⅱ1 型受體相關(guān)蛋白——APJ的內(nèi)源性配體，由77個氨基酸組成，含有前體多肽序列和分泌信號序列[1]。Apelin 廣泛分布于中樞神經(jīng)和外周組織器官中，如神經(jīng)、心血管、骨骼肌和脂肪等[2，3]。以往的研究主要集中在Apelin 作為脂肪因子與肥胖、糖尿病，作為內(nèi)皮因子與心血管和作為內(nèi)分泌因子與神經(jīng)、肺功能等方面的調(diào)節(jié)關(guān)系上[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin與機(jī)體糖代謝調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)系[5]。Apelin基因缺失鼠的葡萄糖耐量和胰島素耐量則明顯降低[6]。

有氧運(yùn)動在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[7]。那么，Apelin缺失是否影響有氧運(yùn)動對糖代謝的調(diào)節(jié)呢？骨骼肌作為機(jī)體的動力源，在運(yùn)動維持血糖平衡中起著重要作用[8]。近年來的研究證明肌肉收縮可增加Apelin mRNA 表達(dá)[9]。胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8 周的跑臺運(yùn)動后，胰島素抵抗減弱，并且比目魚肌和腓腸肌中Apelin 蛋白表達(dá)呈顯著性增加[10]。張靚等對肥胖大鼠進(jìn)行10周跑臺運(yùn)動干預(yù)的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動后肥胖大鼠與未進(jìn)行運(yùn)動的肥胖大鼠相比，比目魚肌中Apelin 表達(dá)增加，并且肌肉中毛細(xì)血管生成增多[11]。另有文獻(xiàn)報道，喂食高脂飼料的Apelin 轉(zhuǎn)基因鼠其骨骼肌葡萄糖氧化能力顯著高于野生鼠[12]。然而，運(yùn)動是否介導(dǎo)Apelin調(diào)控骨骼肌糖代謝，目前仍不清楚。

因此，本研究通過4周有氧運(yùn)動訓(xùn)練，觀察安靜和運(yùn)動兩種狀態(tài)下Apelin 敲除（KO）和野生（WT）小鼠葡萄糖耐量水平和骨骼肌糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，以探究運(yùn)動調(diào)控糖耐量和骨骼肌糖代謝的可能機(jī)制。

1 研究對象和方法

1.1 實驗動物和分組

健康8 周齡的成年C57BL/6J WT 和Apelin KO 鼠各40 只。進(jìn)一步分為野生安靜組、野生運(yùn)動組、敲除安靜組和敲除運(yùn)動組4 組，每組20 只，每組10 只用于糖耐量實驗（GTT），剩余10 只用來測量骨骼肌糖代謝相關(guān)基因mRNA 和蛋白表達(dá)。Apelin KO 鼠由美國Mutant Mouse Resource and Research 中心提供，并由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所保種繁殖，WT來自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。體重為22±2 g，每籠3～4只飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對濕度50%～70%，每天光照12 h，自由進(jìn)食和飲水。該動物實驗方案被北京體育大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 運(yùn)動方案

運(yùn)動組在正式實驗開始前熟悉3天跑臺運(yùn)動。運(yùn)動組進(jìn)行持續(xù)4 周的跑臺運(yùn)動，每周訓(xùn)練6 天，運(yùn)動組在訓(xùn)練前以及運(yùn)動兩周后采用實驗動物呼吸檢測系統(tǒng)（美國Columbus Instruments）測量最大攝氧量，調(diào)節(jié)運(yùn)動強(qiáng)度為70%～75%最大攝氧量強(qiáng)度，即前兩周的運(yùn)動速度為15 m/min，后兩周的運(yùn)動速度為20 m/min，坡度為5°，每天運(yùn)動1小時。

1.3 測試指標(biāo)及方法

1.3.1 小鼠的基因型鑒定

取4周齡所有小鼠的尾尖組織，放入到裝有75 μl堿液的離心管中，95℃孵育40 min。結(jié)束后加入75 μl中和液，常溫靜置5 min，得到提取的小鼠基因組DNA。進(jìn)而，樣品做PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

將以上所有引物混合成為混合引物。PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix12.5 μl，10 μmol/l，混合引物2.5 μl，模板DNA 2.5 μl，加ddH2O 7.5 μl補(bǔ)足25 μl。1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠作為分子量標(biāo)記物，做電泳鑒定。

表1 不同基因型引物序列（5’-3’）

1.3.2 葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance test，GTT）

運(yùn)動組在最后一次運(yùn)動后休息48 小時（自由進(jìn)食），安靜組和運(yùn)動組小鼠禁食16 h后，腹腔注射濃度為100 mg/ml 的D-葡萄糖（1g/kg 體重）溶液。注射前（0 min）及注射后15、30、45、60、90 和120 min 共7 個時間點(diǎn)，采用三諾GA-6 血糖儀（Sinocare，中國）檢測小鼠尾靜脈末梢血糖水平；血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）=（0 min血糖值+15 min血糖值）×15/2+（15 min 血糖值+30 min 血糖值）×15/2+（30 min血糖值+45 min 血糖值）×15/+（45 min 血糖值+60 min血糖值）×15/2+（60 min血糖值+90 min血糖值）×30/2+（90 min 血糖值+120 min 血糖值）×30/2。AUC 代表葡萄糖耐量水平，AUC值越大，代表葡萄糖耐量水平越差。

1.3.3 RT-PCR測定mRNA表達(dá)

運(yùn)動組在最后一次運(yùn)動后休息48 小時（自由進(jìn)食），安靜組和運(yùn)動組小鼠脫頸處死，取小鼠小腿骨骼?。ɑ旌霞。?。800 μl 的Trizol 試劑（Invotrogen）中放入50 mg 骨骼肌，剪碎勻漿后，用三氯甲烷、異丙醇、75%酒精進(jìn)行分離提純總RNA，用Nanadrop 2000（Thermo Scientific，USA）測定RNA 的純度和濃度，選用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo，F(xiàn)SQ101）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后放到-20℃保存，選用的儀器是PCR 擴(kuò)增儀（A100；杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，MG96+/Y）。

采用美國ABI7500熒光定量PCR儀和Toyobo公司生產(chǎn)的熒光染料反應(yīng)體系（SYBR Green Realtime PCR Master Mix），以及德國QIAGEN 公司引物：Apelin （QT00111762），Glut4 （QT01044946），Hk2（QT00155582） ，Pfkm （QT00159754） ，Gbe1（QT00252924），Phka1 （QT00143514）和18S rRNA（QT01036875）。反應(yīng)體系包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，引物2 μl，CDNA 模版2 μl，ddH2O 6 μl。目的基因表達(dá)結(jié)果用比較CT法相對定量，目的基因=2-△△CT[13]。

1.3.4 Western blot 測定蛋白表達(dá)

將骨骼肌組織放入RIPA中，剪碎勻漿，12000 rpm離心30 min 后提取總蛋白。采取BCA 比色方法測量胞漿蛋白濃度（BCA Protein Assay Reagent，23225，Pierce，Thermo Fisher Scientific，USA）。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣體積，上樣蛋白總量為20 μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus 凝膠，NuPAGE MES SDS 電泳緩沖液分離目的蛋白，隨后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上（采用美國Invitrogen 公司的iBot Gel Transfer System）。麗春紅對NC 膜進(jìn)行染色標(biāo)記后，然后采用5%的BSA 進(jìn)行封閉1 h；用相對應(yīng)的一抗進(jìn)行孵育，比例分別為Apelin（1∶1000；PA5-51077，Invitrogen ）；Glut4（1∶2000；ab654，Abcam）；β-actin（1∶2000；sc-477778，Santa Cruz Biotechnology）。洗脫后與相對應(yīng)的二抗反應(yīng)1 h，洗脫后加發(fā)光液（ECL western blot substrate，piece，USA）到NC 膜上，放入BIO-RAD 儀器中進(jìn)行圖像分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。Apelin mRNA 和蛋白含量采用獨(dú)立樣本t檢驗分析。將鼠種（WT鼠、KO鼠）和運(yùn)動方式（安靜、運(yùn)動）作為組間主效應(yīng)，分別對小鼠GTT 的血糖和AUC、Glut4 表達(dá)及糖代謝相關(guān)基因mRNA相對含量進(jìn)行雙因素方差分析；若鼠種與運(yùn)動方式兩因素有交互作用，采用LSD簡單效應(yīng)檢驗；若無交互作用，則采用獨(dú)立樣本T檢驗分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4周有氧運(yùn)動對Apelin KO鼠GTT影響

由圖1數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知，除45 min 血糖值和血糖AUC 外，其余時間點(diǎn)血糖值在鼠種與運(yùn)動方式之間沒有交互作用，采用獨(dú)立樣本T檢驗。圖1A的GTT 結(jié)果顯示，敲除安靜組在45 min、60 min、90 min、120 min 這4 個時間點(diǎn)的血糖值顯著高于野生安靜組（P＜0.05）。野生運(yùn)動組相比野生安靜組各個點(diǎn)血糖沒有顯著性變化；敲除運(yùn)動組在45 min和60 min這兩個時間點(diǎn)血糖顯著低于敲除安靜組（P＜0.05）；敲除運(yùn)動組和野生運(yùn)動組相比，GTT 中各點(diǎn)的血糖值都沒有出現(xiàn)顯著性變化。血糖曲線下面積（AUC）分析表明，敲除安靜組和野生安靜組相比，AUC顯著性增加（P＜0.01）；經(jīng)過4周有氧運(yùn)動后，敲除運(yùn)動組和敲除安靜組相比，AUC顯著性降低（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 Apelin KO 鼠基因型驗證以及野生小鼠骨骼肌內(nèi)Apelin mRNA和蛋白的表達(dá)量

圖2A 為不同基因型小鼠鑒定結(jié)果，DNA 條帶在331bp 的為Apelin KO 鼠，DNA 條帶位于176bp 的為野生型鼠。野生型小鼠運(yùn)動組和安靜組相比，Apelin mRNA和Apelin蛋白表達(dá)沒有出現(xiàn)顯著性變化（圖2B、圖2C）。

圖1 各組小鼠GTT血糖值和血糖曲線下面積圖

2.3 4周有氧運(yùn)動對Apelin KO鼠骨骼肌Glut4 mRNA和蛋白的影響

由圖3數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知，Glut4 mRNA 相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)在鼠種和運(yùn)動方式之間沒有交互作用，采用獨(dú)立樣本T檢驗。如圖3所示：敲除安靜組和野生安靜組相比，骨骼肌內(nèi)Glut4 mRNA和蛋白表達(dá)都顯著性降低（P＜0.05）。經(jīng)過4周有氧運(yùn)動后，野生運(yùn)動組和野生安靜組相比Glut4 mRNA 和蛋白表達(dá)沒有出現(xiàn)顯著性變化；敲除運(yùn)動組和敲除安靜組相比，Glut4 mRNA 含量顯著性增加（P＜0.05），但是其蛋白表達(dá)沒有明顯變化。敲除運(yùn)動組和野生運(yùn)動組相比，骨骼肌內(nèi)Glut4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著性減少（P＜0.05）。

圖2 Apelin KO鼠基因型驗證以及各組骨骼肌Apelin mRNA和蛋白的表達(dá)

2.4 4 周有氧運(yùn)動對Apelin KO 鼠骨骼肌糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知，Gbe1，Phka1，Hk2 和Pfkm mRNA 相對表達(dá)量在鼠種和運(yùn)動方式之間沒有交互作用，采用獨(dú)立樣本T 檢驗。如圖4所示，敲除安靜組和野生安靜組相比，骨骼肌內(nèi)Gbe1，Phka1，Hk2和Pfkm 的mRNA 表達(dá)顯著性減少（P＜0.05）。經(jīng)過4 周有氧運(yùn)動后，敲除運(yùn)動組與敲除安靜組相比，Gbe1，Phka1和Hk2 mRNA表達(dá)顯著性提高（P＜0.05）；同時敲除運(yùn)動組和野生運(yùn)動組相比，骨骼肌內(nèi)Gbe1，Hk2 和Pfkm三個基因mRNA的表達(dá)顯著性降低（P＜0.05）。

圖3 各組Glut4 mRNA和蛋白表達(dá)變化

圖4 各組糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化

3 分析討論

3.1 Apelin基因敲除對糖耐量和骨骼肌糖代謝的影響

葡萄糖耐量反映機(jī)體對血糖濃度平衡的調(diào)節(jié)能力。研究已發(fā)現(xiàn)Apelin KO 鼠的糖耐量和野生鼠相比顯著性降低，呈現(xiàn)糖耐量受損現(xiàn)象[6]，我們的實驗結(jié)果與其相一致。骨骼肌占人體體重的40%以上，是攝取和利用葡萄糖的主要部位，在體內(nèi)糖代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。Apelin 與骨骼肌葡萄糖代謝密切相關(guān)，骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12中加入Apelin能夠促進(jìn)其吸收葡萄糖的能力[6]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glucose Transporter-4，Glut4）作為葡萄糖進(jìn)入肌細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其表達(dá)水平可影響組織細(xì)胞對葡萄糖的攝取，2型糖尿病人慢肌纖維中Glut4 蛋白表達(dá)量降低是造成其骨骼肌攝取葡萄糖能力下降的重要原因[14]。Gbe1和Phka1分別是編碼糖原分支酶（Glycogen branching enzyme 1，Gbe1）和磷酸激酶調(diào)節(jié)亞單位a1（Phosphorylase b kinase regulatory sbunit alpha 1，Phka1）的基因。Gbe1 主要參與合成糖原α-1，6-糖苷鍵從而促進(jìn)糖原分支的形成[15]；Phka1 促進(jìn)糖原的分解[16]。骨骼肌內(nèi)Gbe1和Phka1基因表達(dá)的增加能夠增加骨骼肌對于葡萄糖的吸收[17]。而糖酵解是葡萄糖能量代謝的重要途徑。Hk2和Pfkm可分別編碼骨骼肌中糖酵解途徑中重要的限速酶己糖激酶（Hexokinase 2，Hk2）和磷酸果糖激酶肌同工酶（phosphofructokinase muscle isozyme，Pfkm）。有研究報道2 型糖尿病大鼠的骨骼肌內(nèi)Hk2表達(dá)水平顯著下降[18]以及糖耐量受損小鼠骨骼肌Pfkm表達(dá)也顯著降低[19]。在本研究中，Apelin KO鼠骨骼肌Glut4 mRNA 和蛋白以及糖代謝相關(guān)基因Gbe1，Phka1，HK2 和Pfkm 的mRNA 表達(dá)與野生鼠相比顯著下降。以上表明，Apelin 缺失會影響骨骼肌轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖的利用。而骨骼肌葡萄糖攝取和代謝能力的下降可能是導(dǎo)致Apelin KO鼠糖耐量受損的重要原因。

3.2 4 周有氧運(yùn)動對WT 鼠糖耐量和骨骼肌Apelin 及糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

運(yùn)動的方式、時間以及強(qiáng)度不同會影響機(jī)體糖代謝對運(yùn)動的適應(yīng)，引起運(yùn)動干預(yù)后不同的糖耐量變化。MacDonald 等對假性手術(shù)對照SD 大鼠進(jìn)行為期4周遞增強(qiáng)度的運(yùn)動后，其GTT 的AUC 顯著減少[20]。而Bradley等對WT鼠進(jìn)行6周自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動后，發(fā)現(xiàn)糖耐量的變化不大[21]。同樣，在我們的研究中，WT鼠經(jīng)過4周有氧運(yùn)動后GTT的AUC水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化。這可能是由于正常的WT 小鼠自身的糖代謝處于穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，而本實驗的運(yùn)動強(qiáng)度和運(yùn)動時間沒有打破其自身的穩(wěn)態(tài)，因此，4周運(yùn)動訓(xùn)練對其糖耐量水平影響較小。

骨骼肌作為內(nèi)分泌器官，研究已發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動可促進(jìn)人體[9]、胰島素抵抗大鼠[10]和肥胖大鼠[11]骨骼肌Apelin表達(dá)，Apelin 被認(rèn)為是運(yùn)動可誘導(dǎo)產(chǎn)生的一個新的肌肉因子[9]。但是，也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)6 周運(yùn)動可抑制Zucker肥胖大鼠紅肌纖維中Apelin 蛋白的表達(dá)，對白肌纖維內(nèi)Apelin蛋白表達(dá)沒有影響[22]。以上表明運(yùn)動強(qiáng)度、時間、種屬以及肌纖維類型等都可能影響骨骼肌的Apelin 表達(dá)。在我們的實驗中，4 周有氧運(yùn)動并沒有引起WT 骨骼?。ɑ旌霞。〢pelin mRNA 和蛋白表達(dá)的顯著性變化，也沒有引起骨骼肌Glut4，Gbe1，Phka1，HK2和Pfkm mRNA和Glut4蛋白表達(dá)發(fā)生顯著性變化。結(jié)果提示該運(yùn)動訓(xùn)練方案對正常WT 鼠Apelin 表達(dá)以及骨骼肌糖代謝的調(diào)節(jié)作用不大。

3.3 4 周有氧運(yùn)動對Apelin KO 鼠糖耐量和骨骼肌糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

有氧運(yùn)動可促進(jìn)糖代謝，調(diào)節(jié)能量代謝[23，24]，是糖尿病、肥胖預(yù)防和治療的基石[25，26]。大量的研究證明有氧運(yùn)動能夠改善因不同原因?qū)е碌奶悄土肯陆?。高脂飲食可?dǎo)致WT 鼠的糖耐量下降，而10 周有氧跑臺運(yùn)動顯著提高糖耐量水平[27]。6 周跑輪運(yùn)動可顯著降低飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的糖耐量水平，并提高其胰島素敏感性[21]。我們的實驗結(jié)果顯示，4周有氧運(yùn)動能夠顯著改善Apelin 缺失造成的糖耐量下降，可使其糖耐量水平達(dá)到WT鼠水平。

另外，4周有氧運(yùn)動可顯著提高Apelin KO 鼠骨骼肌內(nèi)Glut4，Gbe1，Phka1 和Hk2 mRNA 表達(dá)，表明該運(yùn)動訓(xùn)練在一定程度上促進(jìn)了骨骼肌葡萄糖攝取能力、糖原或葡萄糖代謝，可能對改善因Apelin 缺失造成的小鼠糖耐量受損起到積極作用。但是，4周運(yùn)動訓(xùn)練后Apelin KO 鼠糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化與同樣訓(xùn)練的WT 鼠相比，仍然存在顯著性下降的差異，這說明在骨骼肌中Apelin的缺失仍然會影響有氧運(yùn)動對骨骼肌糖代謝的調(diào)節(jié)作用。在本實驗中，有氧運(yùn)動除了對骨骼肌糖代謝有一定改善作用外，對其他組織器官，如肝臟、胰臟等可能也有積極的調(diào)節(jié)作用，這些因素共同促進(jìn)了Apelin KO鼠糖耐量的改善，使得Apelin KO鼠的糖耐量水平達(dá)到正常WT 鼠水平。關(guān)于其具體的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動訓(xùn)練可有效改善Apelin缺失造成的糖耐量受損。但在實驗中我們沒有按照肌纖維類型進(jìn)行取材，對骨骼肌糖代謝的研究也不夠全面，存在著一定的局限性。在今后的研究中，將進(jìn)一步深入研究Apelin在有氧運(yùn)動訓(xùn)練對骨骼肌糖代謝的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

Apelin KO鼠的糖耐量受損，骨骼肌葡萄糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低；4周有氧運(yùn)動可明顯改善Apelin KO 鼠的糖耐量降低，對骨骼肌糖代謝相關(guān)基因表達(dá)有一定的積極促進(jìn)作用。