蘇燕妮

自19世紀(jì)40年代末基因?qū)蚣僬f(shuō)的誕生就標(biāo)志著分子生物學(xué)手段在植物抗病性研究中奠定了基礎(chǔ)。植物抗病基因反映了植物對(duì)特體病原體的識(shí)別以及植物能否啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)的能力，抗病基因編碼的產(chǎn)物決定了植物是否能識(shí)別特異性的病原菌，同時(shí)也在對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)有著直接或間接的影響。植物中存在著抗侵染、抗擴(kuò)展、預(yù)成抗性、誘導(dǎo)抗性、結(jié)構(gòu)抗性、生化抗性、過(guò)敏性壞死反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性等。在1992年第一個(gè)抗病基因（Hml）被分離后，陸續(xù)有很多抗病基因被分離。

1 植物抗病基因類(lèi)型

大多數(shù)植物抗病基因可根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)的不同分為五大類(lèi)。通過(guò)對(duì)已經(jīng)克隆的抗病基因的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)抗病基因之間具有一些共同的結(jié)構(gòu)域，即：核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS，nucleotide）、富亮氨酸重復(fù)（LRR，leucine-rich repeat）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TM，transmembrane domain）、絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)（STK， serine/threonine kinases）、亮氨酸拉鏈（LZ，leucine）、Toll-白介素-1區(qū)域等（TIR，toll-interleukin-1 region）。

2 植物抗病基因研究方法

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展并且與基因組學(xué)的結(jié)合使得基因克隆技術(shù)不斷創(chuàng)新，不斷進(jìn)步，很多種基因克隆方法也在此過(guò)程中產(chǎn)生。

2.1 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)（Transponson tagging）

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)利用轉(zhuǎn)座子這樣的一段可以從一個(gè)基因座位移動(dòng)到其它基因座位的特異DNA片段作為探針獲得完整基因的技術(shù)方法。它很早就已發(fā)展成為一個(gè)高效率研究功能基因的主要工具之一，此項(xiàng)技術(shù)在后來(lái)的研究中又陸續(xù)得到了很多植物的抗病基因，比如番茄抗葉霉病基因Cf-9、Cf-4、Cf-5;煙草花葉病毒基因N;番茄抗花葉病毒基因Tm-2;亞麻的抗葉銹病基因L6等。

2.2 染色體移步法（Chromo

some Walking）

染色體步移技術(shù)是一種可以得到與已知基因序列相鄰的未知基因序列的方法。根據(jù)已公布的基因或已知的分子標(biāo)記連續(xù)步移，獲得重要調(diào)控基因，例如啟動(dòng)子的克隆及其功能的研究;應(yīng)用該方法獵取目標(biāo)植物中某段基因的非保守區(qū)域，就能得到一條相對(duì)完整的目的基因序列。此項(xiàng)技術(shù)適用于大多數(shù)基因組序列尚未知曉的生物，如果想得到某個(gè)區(qū)域兩端的DNA序列，染色體步移法是個(gè)高效的途徑。

2.3 圖位克隆法（Map-based cloning）

根據(jù)目標(biāo)基因序列在相應(yīng)染色體上的位置進(jìn)行克隆的方法，又稱(chēng)定位克隆法（positional cloning）。經(jīng)常在基因表達(dá)產(chǎn)物未知和沒(méi)有適宜的相對(duì)表型的產(chǎn)物功能信息的情況下應(yīng)用，該項(xiàng)技術(shù)經(jīng)常與分子標(biāo)記等相關(guān)技術(shù)配套使用，隨著其他幾項(xiàng)技術(shù)的日趨成熟，圖位克隆法的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛。通過(guò)與序列數(shù)據(jù)庫(kù)以及分子標(biāo)記方法的結(jié)合，人們已經(jīng)克隆得到了很多抗病基因，以小基因組的模式植物為主，比如番茄抗霜霉病基因Pto。這種方法同樣也存在著一定的局限性，在實(shí)際中因其構(gòu)建的克隆群難度較大，提供不了基因功能的相關(guān)信息以及精細(xì)作圖成本太高等問(wèn)題都限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

2.4 mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differetial display）

克隆差異性表達(dá)基因的高效率且方便的途徑。目前已廣泛應(yīng)用于對(duì)比植物差異表達(dá)基因和尋找抗病基因中。mRNA差異顯示技術(shù)具有高效、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、周期短、可逐步驗(yàn)證等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用該技術(shù)可同時(shí)比較多個(gè)樣品基因表達(dá)間的差異，對(duì)RNA量的要求也不高，操作周期一般在8天左右。隨著該項(xiàng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，mRNA差異顯示技術(shù)可以在克隆差異基因的基礎(chǔ)上用來(lái)尋找抗病基因。

2.5 同源序列克隆法

關(guān)于抗病基因的研究一直以來(lái)都是人們研究的熱點(diǎn)，伴著現(xiàn)代分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，人們應(yīng)用圖位克隆法（Map-based cloning）和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（Transposon tagging）克隆出許多有意義的植物抗病基因，這對(duì)植物生產(chǎn)以和各個(gè)學(xué)科的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。但是這兩種方法都有一定的局限性，只能克隆基因組較小，遺傳圖譜和物理圖譜有高的分辨率的植物基因，而不適用于基因組大，重復(fù)序列多，分子標(biāo)記圖譜比較難構(gòu)建的植物中。而同源序列克隆法是根據(jù)抗病基因的表達(dá)的蛋白功能保守區(qū)設(shè)計(jì)合適的引物，并擴(kuò)增目標(biāo)基因組DNA或者cDNA，從而從植物體中得到一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)上與抗病基因相關(guān)的片段。在R基因庫(kù)中篩選得到的片段，比對(duì)序列的同源性，分析得到的序列與已知R基因是否有聯(lián)系，進(jìn)一步得到抗病基因相關(guān)序列的目的。該方法的理論依據(jù)是雖然抗病基因識(shí)別的病原種類(lèi)有區(qū)別，但是抗病基因編碼的蛋白質(zhì)具有同源序列，因此，根據(jù)這些同源序列設(shè)計(jì)引物尋找抗病目的基因是可行的。當(dāng)然還有很多通過(guò)生物信息學(xué)方法和高通量測(cè)序的方法來(lái)尋找植物抗病相關(guān)基因，這些方法都會(huì)在人們對(duì)抗病基因探索的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。