宋 偉，韓 芳，丁 磊，周典兵，賈學(xué)穎，呂亞寧，鄧曉軍，鄭 平*，盛 旋，胡艷云

(1.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，安徽 合肥 230022；2.食品安全分析與檢測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022；3.上海檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200135)

生姜精油為姜塊莖經(jīng)干燥、磨碎并用水蒸氣蒸餾制得的揮發(fā)油[1]，主成分為姜烯、生姜酚、姜醇、姜酮、檸檬醛、水芹烯等[2-3]。生姜精油主要用于配制食用香精、含酒精飲料、軟飲料和糖果，也用于香水等化妝品。在個(gè)人護(hù)理品領(lǐng)域，生姜精油因具有消散淤血、促進(jìn)血液循環(huán)之功效被廣泛用作單方或復(fù)方精油[4-6]。但由于生姜精油成分復(fù)雜，產(chǎn)地分散，加之生長(zhǎng)環(huán)境和生產(chǎn)工藝的影響，易造成產(chǎn)品品質(zhì)的差異，開展科學(xué)有效的生姜精油分析、評(píng)價(jià)方法，對(duì)于該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制、摻假識(shí)別、產(chǎn)地溯源等具有重要意義。

目前生姜精油的檢測(cè)方法主要為氣相色譜法，但該方法易導(dǎo)致樣品中相關(guān)成分發(fā)生熱分解，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。超高效合相色譜技術(shù)(Ultra performance convergence chromatography，UPC2)兼具超臨界流體色譜與傳統(tǒng)高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，以超臨界CO2為流動(dòng)相主體，黏度系數(shù)較低、傳質(zhì)性能好，既能分析不適用于氣相色譜的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)、遇熱不穩(wěn)定樣品，又具有比高效液相色譜更高的選擇性和更快的分析速度，且無(wú)需大量的有機(jī)試劑作流動(dòng)相，綠色環(huán)保。UPC2技術(shù)已成功應(yīng)用于食品檢測(cè)、中藥成分檢測(cè)及質(zhì)量控制、脂類和脂肪酸類分析、天然產(chǎn)物分析等領(lǐng)域[7-15]，但在精油分析領(lǐng)域的應(yīng)用研究較少。將UPC2技術(shù)應(yīng)用于生姜精油特征圖譜采集分析，既可避免熱不穩(wěn)定成分發(fā)生分解，又可縮短樣品分析時(shí)間，為生姜精油分析提供了一種新手段。

目前特征圖譜結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法在產(chǎn)品質(zhì)量控制、摻假識(shí)別及產(chǎn)地溯源等方面已有一定應(yīng)用[16-18]。本文采用超高效合相色譜建立了生姜精油的特征峰二極管陣列(PDA)光譜譜圖庫(kù)及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照特征圖譜采集方法，并利用聚類分析及主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地生姜精油進(jìn)行了區(qū)分。該方法無(wú)需衍生化處理，樣品直接稀釋后進(jìn)樣，操作簡(jiǎn)便、快速，綠色環(huán)保，可應(yīng)用于生姜精油的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity超高效合相色譜儀，配ACQ-UPC2-PDA 檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；CO2(純度≥99.999%，合肥眾益化工產(chǎn)品有限公司)；甲醇、異丙醇、乙腈、正庚烷、異辛烷和正己烷均為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。生姜精油由安徽省土產(chǎn)進(jìn)出口有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高效合相色譜條件Acquity UPC2HSS C18SB色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為40 ℃；系統(tǒng)背壓為13.8 MPa；柱流速為0.8 mL/min；樣品室溫度為20 ℃；進(jìn)樣量為4 μL；PDA波長(zhǎng)采集范圍為200～310 nm；流動(dòng)相為超臨界CO2(A)，助溶劑為乙腈(B)。梯度洗脫程序：初始流動(dòng)相100%A,保持2 min；2～3 min，100%～99.8%A，保持2 min；5～6 min，99.8%～99.5%A，保持2 min；8～10 min，99.5%～98.0%A，保持2 min；之后由98.0%A升至100%A，保持5 min。

1.2.2 樣品處理取生姜精油適量以正庚烷稀釋10倍，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后直接進(jìn)行UPC2分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析利用儀器Empower軟件中光譜檢索功能，以生姜精油特征峰的PDA光譜圖建立光譜譜圖庫(kù)，將樣品色譜峰的出峰時(shí)間及光譜圖與生姜精油特征峰PDA譜圖庫(kù)檢索比對(duì)，識(shí)別生姜精油的特征成分。比較樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 稀釋溶劑及流動(dòng)相助溶劑的選擇根據(jù)生姜精油的稀釋溶解性，考察了正己烷、正庚烷、正庚烷-異丙醇(體積比1∶1)3種稀釋溶劑的影響。結(jié)果顯示，采用正己烷、正庚烷溶解稀釋時(shí)，生姜精油的超高效合相色譜圖差異不大，但稀釋溶劑中加入異丙醇后，部分成分的色譜峰分離度變差。由于正庚烷的毒性較低，綜合考慮最終選擇正庚烷為樣品稀釋溶劑。UPC2的流動(dòng)相主要是超臨界CO2，加入甲醇、異丙醇、乙腈等助溶劑可使超臨界流體的溶劑化能力增強(qiáng)，增大流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物的溶解性，改善目標(biāo)化合物的保留時(shí)間及峰形[19]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用100%超臨界CO2進(jìn)行分離時(shí)，由于流動(dòng)相極性太弱，生姜精油的多數(shù)特征成分不能被有效洗脫。為改善分離效果，考察了甲醇、異丙醇、乙腈、正己烷-異丙醇(4∶1)4種助溶劑對(duì)生姜精油特征圖譜的影響。結(jié)果表明，甲醇、異丙醇兩種助溶劑的洗脫能力過(guò)強(qiáng)，對(duì)于部分化合物無(wú)法有效分離；正己烷-異丙醇(4∶1)的洗脫能力較弱，色譜峰分離時(shí)間較長(zhǎng)，峰形較差；而采用乙腈梯度洗脫時(shí)，色譜峰分離效果相對(duì)較好，且對(duì)于紫外吸收波長(zhǎng)較低化合物的影響更小，基線更平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈為助溶劑。

2.1.2 動(dòng)態(tài)背壓的選擇動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)決定CO2的超臨界流體狀態(tài)，是影響超高效合相色譜分離過(guò)程的重要因素。不同的動(dòng)態(tài)背壓下，超臨界CO2對(duì)樣品的溶解能力不同[20]?？疾炝藙?dòng)態(tài)背壓(11.0、12.4、13.8、15.2、16.5 MPa)對(duì)樣品分離度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)動(dòng)態(tài)背壓為11.0 MPa時(shí)，超臨界CO2流體密度較小，溶解能力差，不能對(duì)生姜精油中的化合物進(jìn)行有效分離洗脫。隨著動(dòng)態(tài)背壓的增大，超臨界CO2流體的洗脫能力增強(qiáng)，生姜精油中化合物得到分離，且保留時(shí)間提前，但超臨界CO2的流體密度及黏度隨之增加，柱壓升高。綜合考慮，選擇動(dòng)態(tài)背壓為13.8 MPa。

圖1 生姜精油的3D超高效合相色譜圖Fig.1 3D UPC2 chromatograms of ginger essential oil

圖2 11批生姜精油的超高效合相色譜特征圖譜(214 nm)Fig.2 UPC2 specific chromatograms of 11 ginger essential oils(214 nm)

2.1.3 梯度洗脫條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，初始流動(dòng)相中含有少量助溶劑時(shí)，會(huì)造成色譜峰過(guò)于集中。為改善目標(biāo)化合物的峰形及保留時(shí)間，梯度洗脫條件設(shè)置初始流動(dòng)相為100%CO2，運(yùn)行2 min后再緩慢加入少量助溶劑，從而增強(qiáng)了生姜精油成分的分離效果。在“1.2.1”最佳色譜分離條件下，獲得生姜精油的3D超高效合相色譜圖(見圖1)，整體分離效果較好且采集時(shí)間較短。

2.2 方法學(xué)考察

考慮到樣品在214 nm波長(zhǎng)下的色譜峰較為豐富，且強(qiáng)度均衡，最終選擇在214 nm下建立生姜精油的超高效合相色譜特征圖譜。以同一稀釋樣品連續(xù)采集色譜圖6次，共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.83%～1.6%和1.2%～2.0%，儀器穩(wěn)定性和精密度良好。制備稀釋樣品6份，分別采集色譜圖，共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別為1.0%～1.9%和 1.4%～2.4%，方法重現(xiàn)性良好。制備稀釋樣品分別于 0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD分別為1.4%～2.3%和 1.6%～2.8%，方法穩(wěn)定性良好。

2.3 安徽產(chǎn)生姜精油標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的建立

連續(xù)采集11批安徽產(chǎn)生姜精油樣品的超高效合相色譜特征圖譜，選擇峰形較好、共有率大于70%、相對(duì)保留時(shí)間及光譜圖匹配度高的峰作為共有特征峰，最終標(biāo)記出20個(gè)共有特征峰(見圖2)。采用中位數(shù)矢量法，以所有共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和平均峰面積建立生姜精油的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，并以特征峰的PDA光譜圖建立光譜譜圖庫(kù)。

選擇夾角余弦法作為相似度評(píng)價(jià)依據(jù)，對(duì)不同圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，所得相似度數(shù)值越接近1，說(shuō)明圖譜間的相似度越高[21]。另取10份安徽產(chǎn)生姜精油樣品進(jìn)行超高效合相色譜特征圖譜采集，與生姜精油的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10份生姜精油色譜特征圖譜的相似度均大于0.9，表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜代表性良好，可應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制。

圖3 20份生姜精油的聚類分析圖Fig.3 Dendrogram of 20 ginger essential oils

圖4 20份生姜精油的主成分分析得分投影圖Fig.4 PCA scatter PC1-PC2 biplot grouping of 20 ginger essential oils

2.4 產(chǎn)地溯源分析

2.4.1 聚類分析對(duì)20批不同來(lái)源的生姜精油進(jìn)行超高效合相色譜特征圖譜采集，其中1～10號(hào)生姜精油為安徽產(chǎn)地樣品，11～20號(hào)為山東產(chǎn)地樣品。以20個(gè)共有峰峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間連接的方法，以歐氏距離、平方歐氏距離、馬氏距離、閔氏距離等常用Q型聚類進(jìn)行對(duì)比，確定平方歐氏距離效果最好。以平方歐氏距離為度量準(zhǔn)則，對(duì)20批樣品所得數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，20批生姜精油可被分為兩大類，1～10為第Ⅰ類，11～20為第Ⅱ類。兩個(gè)產(chǎn)地的生姜精油樣品實(shí)現(xiàn)了區(qū)分。

2.4.2 主成分分析運(yùn)用PCA分析法對(duì)不同產(chǎn)地樣本各特征峰的響應(yīng)值計(jì)算因子特征值和方差分析，結(jié)果表明前2個(gè)主成分的特征值大于1，分別為14.070和3.798，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.34%，所以選取前2個(gè)主成分。根據(jù)PCA總貢獻(xiàn)率超過(guò)85%即可使用的原則[11]，前2個(gè)主成分能夠代表生姜精油超高效合相色譜特征峰的整體信息，原來(lái)20個(gè)變量反映的信息可由2個(gè)主成分反映。利用主成分1和2的標(biāo)準(zhǔn)化得分作圖，可以看出不同產(chǎn)地生姜精油有各自的分布空間(圖4)。超高效合相色譜特征圖譜技術(shù)結(jié)合主成分分析可以應(yīng)用于不同產(chǎn)地生姜精油的區(qū)分，但基于樣本的局限性，仍需擴(kuò)大采樣量和采樣地區(qū)，進(jìn)而篩選并建立更有效的溯源和判別模型。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)樣品稀釋溶劑、流動(dòng)相助溶劑、動(dòng)態(tài)背壓等分離條件的優(yōu)化，建立了生姜精油的UPC2-PDA譜圖庫(kù)及生姜精油特征圖譜采集方法。以相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合PDA光譜圖檢索識(shí)別超高效合相色譜特征峰，對(duì)樣品特征圖譜與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，可應(yīng)用于生姜精油產(chǎn)品質(zhì)量控制。同時(shí)結(jié)合聚類分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)生姜精油產(chǎn)地溯源進(jìn)行了初步探索，成功對(duì)20批不同來(lái)源的樣本進(jìn)行了區(qū)分。所建立的生姜精油UPC2特征圖譜技術(shù)具有過(guò)程簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、環(huán)境污染小等特點(diǎn)。但由于樣品數(shù)量和產(chǎn)地來(lái)源較少，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在局限性，后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，建立并完善溯源和判別模型，以更好地應(yīng)用于生姜精油質(zhì)量鑒定及產(chǎn)地溯源。