杜玉梅，周洋洋，卞曉軍，2，3，顏 娟，2，3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)，上海 201306)

納米生物技術(shù)如今在多種領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-3]。1996年Mirkin等[4]首次提出通過金硫共價鍵在納米金顆粒表面組裝巰基DNA。納米金(Au nanoparticles,AuNPs)具有功能性的表面、良好的生物相容性、較低的毒性等特殊性質(zhì)，可以和寡核苷酸鏈、蛋白質(zhì)等組裝[5]。與生物材料相結(jié)合后的納米金化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定，較大的表面積形成的自組裝平臺可提供更多的結(jié)合位點。基于納米金的多重優(yōu)越性，以金屬納米顆粒為載體構(gòu)建的各種功能性納米生物探針或者傳感器已被廣泛應(yīng)用于生物成像以及分子檢測[6-7]。

適配體[8](Aptamer)是一段通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選而來的寡核苷酸序列，能夠高特異性和高選擇性的識別細胞、核酸、蛋白質(zhì)和小分子等靶分子[9-10]。相比于抗體，適配體易于合成和修飾、熱穩(wěn)定性好、成本較低、無毒性。因此，基于適配體的生物傳感器已被廣泛應(yīng)用于各種分析檢測[11-12]。單純的依賴適配體捕獲靶標前后構(gòu)象變化[13]產(chǎn)生的信號，在檢測方面的應(yīng)用十分有限。為了進一步提升適配體生物傳感器應(yīng)用的廣泛性，常常需要結(jié)合信號放大策略。尤其是基于核酸擴增的信號放大策略[14]，包括聚合酶鏈式反應(yīng)[15](Polymerase chain reaction,PCR)以及滾環(huán)擴增技術(shù)[16-17](Rolling circle amplification,RCA)和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等。然而PCR技術(shù)不僅需要嚴格的溫度控制，也需要擴增模板。等溫核酸擴增中[18-19]，RCA不僅需要環(huán)狀模板，還需要特殊的引物設(shè)計；LAMP[20]雖不需要模板，但其需要多條引物以及設(shè)計復(fù)雜等弊端對該技術(shù)的廣泛使用造成了一定的限制。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)[21-24]是一種在寡核苷酸鏈的3′-OH 端重復(fù)添加單核苷酸的酶，該操作無需模板和溫度控制，常溫下就能實現(xiàn)DNA鏈的末端延伸。

恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)別稱乙基環(huán)丙沙星，是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[25]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各種動物感染性疾病的預(yù)防和治療，尤其近年來，在水生動物疾病防治中的應(yīng)用發(fā)展迅猛。然而ENR的大量使用，造成了其在動物源食品中的過多殘留，這種殘留通過食物鏈的傳遞對人體造成毒副作用[26]。本研究使用ENR的核酸適配體組裝在納米金表面作為識別納米生物探針，結(jié)合磁珠(Microbeads,MBs)分離技術(shù)構(gòu)建針對ENR的適配體傳感器(Aptasensor)，通過TdTase介導(dǎo)的常溫下納米界面DNA的生長，實現(xiàn)了ENR識別信號的放大，從而建立了一種簡單易操作的用于食品中ENR殘留的檢測分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(20 U/μL，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(20×PBS,pH 7.4～7.6)、瓊脂糖IV(TM)、電泳緩沖液(50×TAE,pH 8.4)、4S Red Plus 核酸染色劑(10 000×水溶液)、脫氧核苷酸(dNTP,10 mmol/L)、三磷酸脫氧腺苷(dATP,100 mmol/L)、酪蛋白(Casein)、恩諾沙星(ENR)、諾氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)及環(huán)丙沙星鹽酸鹽(Ciprofloxacin hydrochloride)均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；生物素標記的混合堿基(含有Biotin-dUTP,1 mmol/L，賽默科技有限公司)；3，3’，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，美國Neogen公司)；親和素標記的辣根過氧化物酶(avidin-HRP，eBioscience)；8600-10氨基磁珠(美國Polysciences,Inc.)；牛血清白蛋白(BSA，美國Amresco公司)；氯金酸(美國Strem Chemical 公司)；實驗用水均為Milli-Q水(電阻率18.2 MΩ·cm,Millipore純化系統(tǒng)，美國密理博公司)；涉及的DNA序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并純化，純度為HPLC級，其中DNA1(Aptamer1)為 5'SH-AAAAAAAAAA-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGC-OH-3；DNA2(Aptamer2)為5’-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA -NH2-3’。

恒溫振蕩金屬浴(HCM100-Pro，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)；Synergy2 SLFPTAD 多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；UV-2450紫外可見光光度計(日本島津公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂BIO-RAD Gel Doc XR)；840-030-602-R原子力顯微鏡(布魯克(北京)科技有限公司)；miniG手掌型離心機；Lab dancer 振蕩器；移液器(Thermomixer comfort Eppendorf,德國)；EOS 50D數(shù)字照相機(日本佳能)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金的制備參考經(jīng)典的Frens方法[27]，在圓底燒瓶中倒入49 mL水，加入1 mL 1%氯金酸,加熱回流直至沸騰。待溶液沸騰后加入3.5 mL 1%的現(xiàn)配的檸檬酸三鈉，反應(yīng)20 min后停止加熱。制備完成后將膠體金置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米生物探針Au-DNA1的制備在1 mL 15 nm膠體金(2.3 nmol/L)中加入20 μL 100 μmol/L 的SH-DNA1充分混合，室溫下輕微振蕩過夜孵育[28]。次日加入0.1 mol/L的PB溶液室溫下輕輕振蕩30 min使得終濃度為0.01mol/L，分次加入2 mol/L氯化鈉使得終濃度為0.15 mol/L進行老化，室溫下過夜。之后用0.01 mol/L PB溶液進行離心洗滌(4 ℃，12 000 r/min，20 min)3次，沉淀重懸在200 μL 1×PBS(含137 mmol/L氯化鈉、2.7 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液、2 mmol/L磷酸鉀)中4 ℃保存待用。

1.2.3 納米生物界面DNA的生長建立20 μL的反應(yīng)體系，分別含有10 μL Au-DNA1，4 μL反應(yīng)緩沖液，1 μL末端轉(zhuǎn)移酶，2 μL 1 mmol/L dNTPs(Biotin-dUTP∶dATP=1∶3)[25]，以及3 μL水。將該混合物充分混勻，37 ℃水浴中孵育1 h后用1×PBS緩沖液洗滌3次，最終重懸在20 μL 1×PBS溶液中備用。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳的表征配制1%瓊脂糖凝膠，取擴增前后的樣品8 μL加入預(yù)染色(含0.01%4S Red Plus 核酸染色)的凝膠中，室溫下在1×TAE中以90 V恒定電壓運行30 min，并在凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄。

1.2.5 原子力顯微鏡的表征取5 μL稀釋的樣品滴加至新鮮剝離的云母片，靜置5 min，緩慢滴加水?dāng)?shù)滴，用干凈的洗耳球或者氮氣吹干待測。大氣環(huán)境下在智能成像模式中使用SNL系列的掃描探針對樣品進行掃描。

1.2.6 MBs的活化磁珠活化過程參照產(chǎn)品說明推薦方法進行：取2 mL 50 mg/mL氨基磁珠溶液加入16 mL PWB緩沖液(Pyridine wash buffer,PWB)洗滌后渦旋振蕩充分混合。將離心管放在磁力架上靜置1 min，待上清液澄清后棄掉，重復(fù)洗滌3次。之后用PWB稀釋戊二醛，向磁珠中加入8 mL 5%戊二醛并渦旋混合，室溫下振蕩3 h，期間不斷地渦旋振蕩，以防磁珠下沉。磁分離下多次洗滌直至上清液澄清，之后PWB重復(fù)洗滌4次，最終磁珠重懸在10 mL的1×PBS中備用。

1.2.7 MBs-DNA2的制備取40 μL醛基化磁珠，磁響應(yīng)后棄上清，加入8 μL 100 μmol/L的NH2-DNA2和80 μL 1×PBS充分混勻，37 ℃反應(yīng)過夜孵育。次日，磁分離后加入100 μL 1×PBS洗滌1次。之后100 μL磁珠中加入100 μL 2%BSA室溫封閉1 h，磁分離后沉淀重懸在200 μL 1×PBS溶液中備用。

1.2.8 MBs-ENR-AuNPs三明治夾心適配體傳感器的構(gòu)建建立50 μL的反應(yīng)體系，其分別為10 μL MBs-DNA2，30 μL ENR(空白組是緩沖液)以及10 μL Au-DNA1，充分混勻后在振蕩金屬浴37 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離下收集上清液對比顏色，沉淀物中加入50 μL 1×PBS溶液洗滌1次后備用。

1.2.9 比色測定基于TdTase的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心結(jié)構(gòu)表面的DNA生長后，加入50 μL 2%BSA和50 μL 0.25%Casein溶液聯(lián)合封閉30 min。之后磁分離去上清液，加入稀釋1 000倍的avidin-HRP溶液，室溫孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL 1×PBS(0.2%Tween-20)充分洗滌6次，棄上清液后加入50 μL TMB(含H2O2)避光反應(yīng)5～10 min。磁響應(yīng)后，收集上清顯色溶液于96孔板中使用酶標儀(波長600 nm)測定吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

納米界面DNA生長過程如圖1所示：以15 nm的納米金作為載體，5'端修飾巰基的DNA1鏈通過金硫共價鍵組裝在納米金的表面，剩余活性位點用BSA進行封閉。加入Biotin-dUTP和dAPT的混合溶液[25]，在TdTase的催化作用下，DNA1鏈的3′-OH末端進行延伸生長，得到一段嵌入生物素位點的ssDNA產(chǎn)物。

圖1 基于TdTase的納米界面上的DNA生長示意圖

2.2 AuNPs-DNA1與MBs-DNA2的紫外可見光譜

為考察納米金和磁珠表面組裝DNA后表面結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，實驗對AuNPs以及AuNPs-DNA1進行紫外可見吸收光譜的掃描。結(jié)果顯示，裸金在519 nm處有明顯吸收峰，當(dāng)納米金和SH-DNA1通過金硫鍵共價結(jié)合后，其最大紫外吸收峰發(fā)生紅移，在約522 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰(圖2A)，表明納米金和DNA序列成功組裝。同時，收集磁珠和DNA2組裝后的上清液(即溶液中未與磁珠組裝的游離NH2-DNA2)，測試其在波長260 nm處的吸收峰值為0.53；對比加入的總DNA2量(吸收值為0.70),紫外吸收值降低，即DNA2濃度降低(如圖2B)。DNA2吸收值的變化說明醛基化的磁珠和NH2-DNA2孵育后，一部分的DNA2成功組裝在磁珠表面，從而使得體系中游離NH2-DNA2的數(shù)量減少。

2.3 納米界面DNA生長產(chǎn)物的表征

采用瓊脂糖凝膠電泳成像和AFM成像技術(shù)表征了DNA在納米界面的生長情況。圖3A和B分別為瓊脂糖凝膠在紫外光和白光下的成像結(jié)果。其中M為DNA marker，泳道1的上樣樣品為AuNPs-DNA1；泳道2的樣品為AuNPs-DNA1中加入dATP，以及TdTase進行生長后的產(chǎn)物；泳道3的樣品為AuNPs-DNA1中加入dNTPs，以及TdTase進行生長后的產(chǎn)物；泳道4為MBs-DNA2；泳道5的樣品為MBs-DNA2中加入dATP，以及TdTase進行生長后的產(chǎn)物；泳道6的樣品為MBs-DNA2中加入dNTPs，以及TdTase進行生長后的產(chǎn)物。對比圖3A、B兩圖中的1～3三條泳道成像發(fā)現(xiàn)，2、3樣品位置比樣品1更接近進樣孔，由于擴增產(chǎn)物分子量變大后發(fā)生滯后，說明在TdTase的作用下納米金表面DNA成功延伸生長。然而在白光下雖能發(fā)現(xiàn)泳道2中納米金的條帶(圖3B)，在紫外成像中的相應(yīng)位置卻無DNA條帶(圖3A，泳道2)，這是因為該樣品使用dATP進行DNA生長得到的產(chǎn)物為堿基A組成的長單鏈DNA(poly A)，該鏈由同種堿基組成，不易形成DNA二級結(jié)構(gòu)，從而DNA染色劑(GelRed)不能有效嵌入，致使不能得到明顯的DNA條帶。

實驗繼續(xù)觀察了泳道4～6的成像結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論生長時添加dATP，還是dNTPs，泳道中均未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA條帶。這是因為MBs-DNA2探針表面無供TdTase作用的3′-OH端的位點，無法進行DNA的延伸生長。此結(jié)果不但表明了本研究的可行性，同時也避免了檢測體系中由于MBs表面可能的DNA延伸生長所帶來的背景信號。進一步采用AFM成像技術(shù)提供了更為直觀的表征結(jié)果。圖4A為 AuNPs-DNA1的AFM成像結(jié)果，可觀察到納米金顆粒的粒徑較為均一、分散性良好；然而其表面組裝的單鏈DNA1由于鏈長較短，無法形成明顯成像。經(jīng)過TdTase介導(dǎo)的DNA生長過程之后，納米金顆粒周圍延伸出來多條ssDNA(圖4B)。經(jīng)過測量，在單鏈本身的卷曲狀態(tài)下，產(chǎn)物ssDNA的長度已達850 nm，顯示TdTase在室溫下即已具備高效擴增性能。

2.4 基于TdTase的適配體傳感器用于恩諾沙星的檢測

2.4.1 檢測原理將TdTase-aptasensor應(yīng)用于恩諾沙星標準樣的檢測，其檢測過程如圖5所示。MBs-ENR-AuNPs三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)表面經(jīng)過TdTase介導(dǎo)的DNA生長過程之后，avidin-HRP可與擴增產(chǎn)物ssDNA鏈中嵌入的生物素位點高特異性識別。最后，加入底物TMB，HRP催化H2O2介導(dǎo)的TMB發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的從無色到藍色的顏色變化。

2.4.2 MBs-ENR-AuNPs三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)的驗證將恩諾沙星溶液(1 mg/mL)稀釋成0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 mg/mL系列質(zhì)量濃度溶液，并將制備的AuNPs-DNA1與MBs-DNA2兩種探針混合溶液依次加入上述系列溶液中，混勻并振蕩孵育后，利用磁分離技術(shù)收集上清液。結(jié)果顯示，隨著ENR濃度的遞減，上清液的顏色逐步加深。這表明當(dāng)ENR濃度減少時，無足夠的ENR用于形成MBs-ENR-AuNPs三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)，在磁分離后，上清液中滯留更多的AuNPs-DNA1探針，溶液呈現(xiàn)的紅色加深。此結(jié)果也表明所使用的DNA1與DNA2兩條適配體片段對ENR分子具有良好的識別性能。

圖5 基于TdTase的適配體傳感器用于恩諾沙星檢測的示意圖Fig.5 Schematic diagram of TdTase-aptasensor for ENR detection

2.4.3 納米界面的DNA生長策略用于ENR適配體傳感器的可行性驗證將同等體積的0.1 mg/mL ENR(實驗組)與1×PBS(背景組)分別加入基于TdTase的適配體傳感檢測體系中，按照實驗方法中所述的靶標識別、界面生長、比色測定等一系列步驟后，肉眼觀察并用酶標儀測定兩組吸收值結(jié)果。結(jié)果如圖6A所示，實驗組催化TMB后上清顏色明顯深于背景組(插入圖)；且測定的實驗組的吸收值為0.51，背景組吸收值為0.019。數(shù)據(jù)表明基于TdTase的納米界面DNA生長策略能很好地適用于ENR的適配體傳感器的體系構(gòu)建，通過DNA的生長、生物素位點的嵌入、酶催化信號的測定，可實現(xiàn)對體系中ENR的檢測；并且該體系背景信號較低，實驗組信號明顯優(yōu)于背景組。

DNA生長后產(chǎn)物ssDNA的鏈長決定了產(chǎn)物鏈中嵌入的生物素位點的數(shù)目，從而影響到體系的檢測性能。因此，該實驗中通過采用瓊脂糖凝膠電泳，考察了不同生長時間所得產(chǎn)物ssDNA的分子量，以優(yōu)化實驗中DNA的生長時間。結(jié)果如圖6B所示，泳道1上樣樣品為AuNPs-DNA1，泳道2～4樣品分別是生長時間為30 min、1 h、12 h的擴增產(chǎn)物。通過比較可以看出，與泳道1的AuNPs-DNA1相比，泳道2～4的分子量明顯增大，說明DNA成功延伸生長；進一步對比2～4三條泳道中產(chǎn)物的位置，發(fā)現(xiàn)泳道3，4的產(chǎn)物條帶比產(chǎn)物2更為彌散，說明生成了更多較大分子量的產(chǎn)物，然而產(chǎn)物3和4無明顯差別。這可能是由于實驗使用了較高活性的TdTase(20 U/μL)，其在較短時間內(nèi)即可實現(xiàn)DNA的高效延伸。因此選定1 h作為DNA的最優(yōu)生長時間，并用于后續(xù)ENR的檢測。

圖7 適配體傳感器對0.1 mg/mL ENR的特異性檢測Fig.7 Specificity of the aptamer sensors for 0.1 mg/mL ENR the other antibiotic concentrations：0.5 mg/mL

2.4.4 基于TdTase的適配體傳感器對ENR的響應(yīng)性能分析在上述優(yōu)化實驗條件下，本研究測試了基于TdTase的適配體傳感器對不同濃度ENR的響應(yīng)能力以及特異性。在適配體傳感器中，加入不同濃度ENR溶液。發(fā)現(xiàn)隨著ENR濃度的增大，比色測定所得的吸收值越高。這是因為溶液中ENR分子越多，所形成的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心復(fù)合結(jié)構(gòu)數(shù)量越多，納米界面TdTase介導(dǎo)的DNA生長得到的ssDNA和生物素位點就越多，進而和生物素結(jié)合的avidin-HRP就越多，而更多的HRP催化TMB變色后得到的信號值越高，且波長600 nm處的吸收值與10～1.0×105ng/mL范圍內(nèi)的ENR質(zhì)量濃度呈良好的響應(yīng)關(guān)系；當(dāng)ENR溶液質(zhì)量濃度低至1.0 ng/mL時，發(fā)現(xiàn)其檢測信號與空白組信號相比，仍有較好的區(qū)分。表明該適配體傳感器不但對不同濃度的ENR具有很好的響應(yīng)能力，同時也具備檢測較低濃度靶分子的良好能力。

另外，實驗也測試了該傳感器的檢測特異性，即在適配體傳感器中加入0.1 mg/mL ENR和加入0.5 mg/mL喹諾酮類其他抗生素(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)及緩沖液進行對比。如圖7所示，溶液中的ENR信號值顯著高于其它對照組(環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星)，表明本研究所構(gòu)建的傳感器對ENR具備較好的檢測特異性。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種基于TdTase催化的納米界面上DNA生長策略的適配體比色傳感器。該方法在操作上無需貴重儀器，無需復(fù)雜的樣品前處理和嚴格的變溫操作。在初步應(yīng)用于恩諾沙星標準樣的檢測過程中，發(fā)現(xiàn)基于Aptamer的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心復(fù)合結(jié)構(gòu)使得該傳感器具備良好檢測特異性；此外，由于DNA在納米界面的高效生長，體系中引入更多的HRP分子，使得該傳感器對不同濃度的ENR具備良好的響應(yīng)性能。這為課題組后續(xù)將其應(yīng)用于實際樣品中藥物殘留的檢測奠定了良好基礎(chǔ)。本研究發(fā)展的基于TdTase的適配體傳感器在食品安全檢測、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測等方面均具備良好的應(yīng)用前景。