鄒 陽 王昌興

輕微中樞神經(jīng)損傷是由交通車禍、體育運(yùn)動(dòng)等造成的腦、脊髓輕度挫傷。雖然中樞神經(jīng)輕微傷的嚴(yán)重程度較其他的閉合性神經(jīng)損傷要輕，但仍會(huì)引起細(xì)胞變性和凋亡，逐步影響患者認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力[1]。由于病理機(jī)制尚未明確，且神經(jīng)細(xì)胞再生能力較差，故缺乏有效的治療手段。輕微中樞神經(jīng)損傷屬中醫(yī)“神志病”范疇，辨證為腎陽虧虛。故治療宜溫陽補(bǔ)腎，填精益髓。研究證實(shí)，右歸飲可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[2]。本研究觀察右歸飲對(duì)輕微中樞神經(jīng)損傷模型大鼠海馬組織細(xì)胞自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，及海馬組織細(xì)胞形態(tài)改變的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 雄性Sprague Dawley大鼠48只，清潔級(jí)，4周齡，初始體質(zhì)量85～95g。所有大鼠購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)合格證：SCXK（滬）2012-0002），大鼠的飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作均于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用許可證：SYXK（浙）2013-0184）。

1.2 藥 物 實(shí)驗(yàn)用中藥購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院名中醫(yī)分館，并于中藥室內(nèi)制備。根據(jù)《景岳全書》，方劑右歸飲由熟地黃9g，山藥6g，山茱萸、肉桂各3g，制附子9g，姜杜仲、枸杞各6g，炙甘草3g組成，通過濃縮、干燥后制成細(xì)粉，并溶解于生理鹽水中至0.69g/mL備用。

1.3 試劑及儀器 抗Beclin-1抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號(hào)AF07044415）；抗mTOR抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號(hào)AF12262669）；抗LC3抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號(hào)AF10285813）；超敏酶標(biāo)羊抗兔抗體來自于北京中杉生物公司（批號(hào)107257D9）；熒光羊抗兔抗體來自美國LI-COR公司（批號(hào)C51104-08）；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司（批號(hào)AK1401）；SYBR Premix Ex TaqTMII購自 TaKaRa公司（批號(hào) AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司（批號(hào)AK5101）。AP280-2包埋機(jī)、HM335E切片機(jī)來自德國MICROM公司；Nikon Eclipse 80i顯微鏡來自日本Nikon公司；Carl Zeiss Imaging系統(tǒng)軟件來自德國Carl Zeiss公司；HVP-50高壓滅菌器來自日本HIRAYAMA公司；吸入麻醉機(jī)來自深圳瑞沃德公司；DRP-9052電熱恒溫箱來自上海森信公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將48只SD大鼠分為損傷模型組、右歸飲組和空白對(duì)照組，每組16只。按照Richelle Mychasiuk[3]提出的改良重物自由落體法進(jìn)行造模：將損傷模型組與治療組的大鼠置于吸入麻醉機(jī)中，吸入異氟烷（1%～2%in air/O2 mix）約 3min。當(dāng)大鼠結(jié)膜反射消失、確認(rèn)輕度麻醉后，將大鼠俯臥于錫箔紙平臺(tái)上，下方放置海綿墊保護(hù)。另將一150g重量的砝碼通過釣魚線與鐵架臺(tái)拴住后，置于柱狀聚乙烯管（直徑2cm，長(zhǎng)1.5m）中。將聚乙烯管置于大鼠頭部上方，用插銷固定砝碼于大鼠頭部中心上方0.5m處。撤去插銷后，砝碼自由落下，直接砸中麻醉下的大鼠頭部正中處，大鼠便會(huì)跌落到海綿墊中，而砝碼被釣魚線系在海綿墊上方不繼續(xù)下落，避免二次傷害。持續(xù)造模3天，每天1次。而空白對(duì)照組大鼠則不做任何處理。造模結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)分析，確定造模成功后，對(duì)大鼠進(jìn)行給藥，具體如下：根據(jù)成人日用臨床劑量和前期研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)灌胃時(shí)將右歸飲濃縮至最適濃度，對(duì)右歸飲組大鼠以10g/kg體質(zhì)量的劑量進(jìn)行右歸飲灌胃治療，同時(shí)以等量的生理鹽水對(duì)模型組和空白對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌胃，每天1次，共灌胃4周。

2.2 標(biāo)本和檢測(cè)指標(biāo) 灌胃結(jié)束后，麻醉所有大鼠，取出大鼠的大腦組織，將每組8只大鼠的大腦進(jìn)行石蠟包埋。再將每組剩余8只大鼠大腦的海馬組織分離出，置于-80°C中保存。對(duì)石蠟包埋的標(biāo)本進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測(cè)，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理變化和自噬指標(biāo)mTOR:哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1基因編碼蛋白（Beclin-1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的蛋白表達(dá)情況。冰凍海馬組織蛋白則進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QPCR）檢測(cè)（TaKaRa公司RNA提取試劑說明書，提取大鼠海馬組織后的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并測(cè)定mRNA的表達(dá)量），觀察自噬指標(biāo)mTOR、Beclin-1、LC3基因表達(dá)變化。引物序列見表1。

表1 Beclin-1、LC3、mTOR和 β-Actin引物

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料。對(duì)于屬于正態(tài)分布的三組數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析比較，并進(jìn)行兩兩比較的q檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 海馬組織標(biāo)本病理學(xué)觀察 損傷模型組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目稀少，排列紊亂，較多細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞邊緣較為模糊。右歸飲組大鼠海馬組織細(xì)胞數(shù)目較損傷模型組多，排列較均勻，細(xì)胞邊緣欠清晰?？瞻讓?duì)照組大鼠海馬組織細(xì)胞排列均勻，邊緣清晰，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，胞外基質(zhì)為粉紅色，胞核為深藍(lán)色（見插頁圖1）。

3.2 大鼠海馬組織自噬蛋白表達(dá)變化 與空白對(duì)照組和損傷模型組比較，右歸飲組大鼠自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)的陽性指數(shù)顯著增高，mTOR表達(dá)則降低（P＜0.01，P＜0.05），空白對(duì)照組與損傷模型組之間的蛋白表達(dá)的陽性指數(shù)則無明顯差異（P＞0.05）。見表 2，插頁圖 2-4。

表2 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)陽性指數(shù)比較

表2 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)陽性指數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與損傷模型組比較，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因編碼蛋白；LC3：微管相關(guān)蛋白 1輕鏈 3；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

組別損傷模型組右歸飲組空白對(duì)照組鼠數(shù)888 Beclin-1 0.05±0.05 0.11±0.04**△0.05±0.01 LC3 0.01±0.00 0.03±0.02**△0.01±0.01 mTOR 0.09±0.04 0.03±0.03*△0.08±0.04

3.3 QPCR檢測(cè)大鼠海馬組織自噬相關(guān)基因表達(dá)水平 與空白對(duì)照組和損傷模型組比較，右歸飲組大鼠海馬組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)含量顯著增高（P＜0.01），mTOR 顯著降低（P＜0.01），而空白對(duì)照組與損傷模型組之間的蛋白表達(dá)量則無明顯差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠海馬組織自噬基因mRNA表達(dá)比較

表3 各組大鼠海馬組織自噬基因mRNA表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與損傷模型組比較，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因編碼蛋白；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

組別損傷模型組右歸飲組空白對(duì)照組鼠數(shù)888 Beclin-1 0.34±0.11 1.06±0.21**△0.43±0.36 LC3 1.12±0.09 1.75±0.21**△1.01±0.17 mTOR 1.74±0.73 0.91±0.17**△1.62±0.26

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎主志，生髓通腦。腦為髓海，神經(jīng)損傷后腎精不足，腦髓空虛，不能化生氣血濡養(yǎng)肌肉骨骼，所以認(rèn)知功能不足，小兒發(fā)育遲緩，運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)腎虛模型大鼠溫補(bǔ)腎陽，可以發(fā)現(xiàn)血漿和腦組織EPO表達(dá)含量增加，降低細(xì)胞的凋亡[2]。腎中精氣可化髓充腦，故補(bǔ)腎益精健腦，用于治療中樞神經(jīng)損傷。右歸飲作為補(bǔ)腎溫陽的代表方，溫補(bǔ)腎陽為主，而陰陽兼顧。研究發(fā)現(xiàn)右歸飲可以保護(hù)腎虛模型大鼠損傷的神經(jīng)細(xì)胞，升高大鼠大腦皮質(zhì)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率（Bcl-2/Bax），減少凋亡[2]；在腦脊髓炎軸突損傷的模型中，右歸飲可以防止軸突的再次損傷，并且促進(jìn)軸突的再生，增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)[4]。

自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體機(jī)制降解自身成分的一種代謝途徑，與細(xì)胞的存活、穩(wěn)態(tài)、分化關(guān)系密切。自噬會(huì)清除某些毒素、病原體，還有變性的胞漿成分，中止細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。但自噬的作用具有兩面性，過度激活自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這取決于病變不同階段的環(huán)境變化和治療干預(yù)的不同[5]。近年來，自噬在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病中的研究較多[6-8]，但對(duì)大腦和脊髓等中樞神經(jīng)損傷后自噬發(fā)生的研究較少，而且中樞神經(jīng)損傷后的治療基本上無實(shí)質(zhì)性的突破。自噬主要的調(diào)節(jié)機(jī)制有磷酸肌醇三磷酸激酶（phosphatidylinositol kinase-3 kinase，PI3K）、mTOR 和氨基酸、激素等。mTOR途徑是目前研究最多的信號(hào)途徑的一種，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病關(guān)系密切[9-10]。mTOR是氨基酸和ATP的感受器，當(dāng)AMP激活性蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）感受胞內(nèi)ATP/AMP比值，進(jìn)而通過mTOR信號(hào)啟動(dòng)自噬。Beclin-1及LC3則為自噬相關(guān)性蛋白，其表達(dá)量與自噬的水平呈正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，右歸飲治療后，免疫組化和QPCR的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的海馬組織Beclin-1、LC3的mRNA和蛋白表達(dá)量較損傷模型組和空白對(duì)照組顯著上調(diào)（P<0.01），而mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)量較其余兩組則下調(diào)（P<0.01，P<0.05），說明右歸飲通過下調(diào)mTOR，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，HE染色觀察到右歸飲治療組的海馬組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較損傷模型組多，總體上排列較均勻，表明右歸飲治療后大腦神經(jīng)細(xì)胞的破壞得到有效的緩解。