陳 珍 俞頌平 李 俊 蘭淑琴

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）為50歲以上糖尿病患者的主要致盲原因，是糖尿病的重要并發(fā)癥之一。循環(huán)高血糖狀態(tài)造成機體微血管循環(huán)障礙，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而引發(fā)微血管瘤、出血、滲出、水腫、新生血管形成、黃斑囊樣水腫，以及玻璃體出血、視網(wǎng)膜前出血等一系列的眼底病變。病變早期主要以改善微循環(huán)治療為主，但藥物選擇有限，晚期以視網(wǎng)膜光凝術(shù)以及玻璃體切割手術(shù)為主，但手術(shù)后患者喪失部分視力、視野，給患者帶來永久傷害。

七葉皂苷鈉從七葉樹果實婆羅子中提取的有效成分，具有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)[1-2]。研究表明，七葉皂苷鈉通過減少細(xì)胞消耗三磷酸腺苷，維持血管內(nèi)皮功能，減輕黃嘌呤氧化酶活性而減少氧自由基對機體的作用，進(jìn)而穩(wěn)定血腦屏障，保護(hù)神經(jīng)作用[3-4]。本研究制備糖尿病大鼠模型，觀察七葉皂苷鈉對糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的成年雄性（SD）大鼠（溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK（浙）2010-0044]），約8～12周齡，體質(zhì)量180～220g之間，在普通的環(huán)境下（恒溫18～23℃，通風(fēng)，濕度60%）飼養(yǎng)，喂以普通飼料，自由飲水。

1.2 主要藥物與試劑 注射用七葉皂苷鈉（ESC）購自山東綠葉制藥有限公司，批號2006051329（D1）；鏈脲佐菌素（streptozotosin，STZ），批號CAS18883-66-4、伊文思藍(lán)（Evansblue，EB），批號 CAS314-13-6，購自美國sigma公司；甲酰胺、SDS購自上海生工生物工程有限公司；p-MLC單克隆抗體[3675s]購自Signaling公司；Occludin單克隆抗體、Rock單克隆抗體購自SANTA CRUZ公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、多聚甲醛、水合氯醛購自國藥試劑；ECL化學(xué)發(fā)光液購自Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組 將禁食12h的大鼠按體質(zhì)量（45mg/kg）一次性尾靜脈注射新鮮配制并預(yù)冷的鏈脲佐菌素檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5），誘導(dǎo)糖尿病模型，注射完畢后觀察2h，開始飲食。連續(xù)3天。正常小鼠給予相同體積生理鹽水做為對照。3天后尿糖（+++）以上，空腹血糖16.00mmol/L以上，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食等癥狀即認(rèn)為造模成功，然后隨機分為糖尿病組和七葉皂苷鈉組，每組6只。ESC組大鼠每日定時 ESC 灌胃，劑量為 1.5mg·kg-1·d-1，連續(xù) 12周，每4周監(jiān)測血糖和體質(zhì)量，各組采集6只大鼠數(shù)據(jù)。每4周，水合氯醛麻醉大鼠，每組隨機取2只大鼠眼球（12只眼），用作后續(xù)實驗。

1.3.2 大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲漏值檢測 腹腔注射水合氯醛（50mg/kg）麻醉大鼠，1min內(nèi)尾靜脈注入EB溶液（45mg/kg），循環(huán)2h后，頸靜脈灌注生理鹽水（37℃）2min，即刻取出眼球，檢測EB滲漏值。

1.3.3 Western blot檢測視網(wǎng)膜組織occludin、ROCK和P-MLC蛋白表達(dá)量 摘取大鼠眼球，顯微鏡下分離出視網(wǎng)膜組織，TBS與蒸餾水反復(fù)沖洗，加入細(xì)胞裂解緩沖液，于冰上超聲勻漿，勻漿液于低溫（4℃）離心機（1-14型，美國sigma公司）離心30min，12000r/min，取上清液，蛋白定量，上樣，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗于室溫微搖2h，用PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)入TBS溶液中，室溫微搖10min；與二抗室溫微搖1h，用TBS洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1-3min，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖及體質(zhì)量比較 糖尿病組與正常對照組大鼠在各時間點血糖水平變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），模型組大鼠成模后，血糖水平穩(wěn)定，ESC給藥對血糖未見影響。七葉皂苷鈉組大鼠體質(zhì)量與正常組比較則稍有下降，但明顯比糖尿病組好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），ESC給藥對糖尿病大鼠體質(zhì)量維持有正面影響。見表1-2。

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，

注：與同期正常組比較，*P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗0周4.61±0.68 4.52±0.78 4.51±0.97實驗4周4.60±0.87 27.16±5.74*28.51±5.61*實驗8周4.58±2.61 26.13±5.74*24.53±3.61*實驗12周4.61±1.34 26.30±6.43*24.84±4.03*

2.2 各組大鼠血-視網(wǎng)膜屏障對伊文思藍(lán)（EB）滲漏變化 與正常組比較，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜對EB的滲透量顯著增多（P<0.01）。七葉皂苷鈉組EB滲漏值較糖尿病組明顯降低（P<0.01），且于前4周差異最為明顯。見表3。

2.3 七葉皂苷鈉對DR大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)量的影響 七葉皂苷鈉組大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)量較糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.01），ESC影響大鼠視網(wǎng)膜組織表達(dá)Occludin蛋白，在第8周及12周明顯。見表4、插頁圖1。

表2 各組大鼠體質(zhì)量改變

表2 各組大鼠體質(zhì)量改變

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗0周202.30±14.56 201.31±15.46 204.52±13.86實驗4周261.01±23.80 186.40±15.46*247.03±17.87*△實驗8周315.01±21.54 211.64±19.32*285.47±16.86*△實驗12周363.83±11.23 242.81±7.75*327.82±14.61*△

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織對EB滲漏值比較（ng/mg，

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織對EB滲漏值比較（ng/mg，

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗4周12.34±4.30 26.23±2.00*13.27±0.77△實驗8周12.67±2.11 29.78±1.78*18.01±1.77△實驗12周12.45±4.40 34.08±3.03*21.05±1.50*△

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)量比較

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗4周4.52±0.75 3.59±0.64*4.58±0.53△實驗8周4.67±0.81 2.26±0.45*3.65±0.71△實驗12周4.45±0.78 1.23±0.47*3.45±0.58△

2.4 七葉皂苷鈉對DR大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白/P-MLC蛋白表達(dá)量的影響 七葉皂苷鈉組大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白、P-MLC蛋白表達(dá)量較糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白、P-MLC蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.01）。見表 5-6，插頁圖2-3。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白表達(dá)量比較

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白表達(dá)量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗4周0.74±0.36 1.45±0.53*1.05±0.49△實驗8周0.67±0.81 2.76±0.32*1.84±0.71△實驗12周0.81±0.78 3.82±0.49*2.34±0.51△

表6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織P-MLC蛋白表達(dá)量比較

表6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織P-MLC蛋白表達(dá)量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數(shù)666實驗4周0.52±0.23 0.95±0.62*0.71±0.49△實驗8周0.61±0.41 1.96±0.59*1.01±0.61△實驗12周0.49±0.38 2.67±0.65*1.54±0.51△

3 討 論

DR早期的標(biāo)志性病變?yōu)锽RB的破壞與血管滲透性增加，BRB在調(diào)節(jié)血管通透性、神經(jīng)視網(wǎng)膜組織營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳輸中起重要作用[5-7]。高血糖狀態(tài)下，機體通過激活蛋白激酶C、多元醇、非酶糖基化終產(chǎn)物等通路開啟糖尿病性代謝，致使體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失平衡，過氧化物產(chǎn)生增加，氧化物清除減少，氧化應(yīng)激產(chǎn)生，造成機體損傷，視網(wǎng)膜中的多不飽和脂肪酸含量高，對氧及葡萄糖的需求大，高血糖對于視網(wǎng)膜的損傷尤為明顯，破壞BRB及提高血管通透性。本研究結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉能夠減少DR大鼠視網(wǎng)膜組織的伊文思藍(lán)滲漏，能夠增加DR大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白的表達(dá)以及抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白/P-MLC蛋白表達(dá)，說明七葉皂苷鈉具有保護(hù)DR大鼠BRB的功效。七葉皂苷鈉通過抑制炎性介質(zhì)釋放作用，改善微循環(huán)，穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能，降低毛細(xì)血管通透性[8-9]，在本實驗中表現(xiàn)為降低視網(wǎng)膜組織的伊文思藍(lán)的滲漏。

Occludin是一種跨膜蛋白，其作用是保持上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的完整性，同時形成一種高度極化性的屏障來維持動物體內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定[10]。Occludin蛋白受多種機制調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、粘附分子等炎癥介質(zhì)會導(dǎo)致其表達(dá)下降，從而影響細(xì)胞間的滲透性[11]。有報道顯示，Occludin蛋白在DR視網(wǎng)膜組織中表達(dá)降低[12-13]。七葉皂苷鈉通過降低VEGF表達(dá)[14]，增加組織occludin蛋白表達(dá)量，與本實驗結(jié)果相符；禹海[15]等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中粘附分子與occuldin蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，抑制粘附分子可增加occuldin蛋白表達(dá)。根據(jù)實驗結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉通過增加DR大鼠視網(wǎng)膜組織occludin蛋白表達(dá)保護(hù)DR大鼠BRB。

Rho/ROCK細(xì)胞信號通路與血管通透性的調(diào)節(jié)有密切關(guān)聯(lián)[16]，陳曦等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高血糖環(huán)境誘導(dǎo)Rho/ROCK活化，活化的ROCK上調(diào)TNF-α、ICAM-1表達(dá)，增加白細(xì)胞粘附，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。在本實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜疾病時以及在糖尿病視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)過程中，ROCK通路一直處于激活狀態(tài)，而其底物MLC的磷酸化水平也不斷地升高，與Arita等[18]研究相符。根據(jù)實驗結(jié)果，七葉皂苷鈉能夠抑制視網(wǎng)膜組織ROCK蛋白及P-MLC蛋白表達(dá)量，考慮七葉皂苷鈉通過抑制ROCK/P-MLC通路激活而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用，從而保護(hù)BRB功能；但其具體作用靶點不得而知，需進(jìn)一步實驗研究，這也是本實驗的不足之處。

綜上所述，七葉皂苷鈉可能通過提升occludin蛋白表達(dá)量，抑制ROCK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，穩(wěn)定BRB功能，阻止糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展，其具有改善大鼠DR的藥效活性。