姚添淇，勞翠瑜，王士峰，胡桂平，張世偉*

（廣東省深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國(guó)家營(yíng)養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東 深圳 518060）

糖皮質(zhì)類激素是類固醇激素類的一種，具有強(qiáng)大的抗炎、抗過(guò)敏、免疫抑制和抗增生的作用[1]。在養(yǎng)殖業(yè)方面，糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)動(dòng)物的非正常生長(zhǎng)，可以大幅提高動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，所以在養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用[2]。但是濫用糖皮質(zhì)類激素會(huì)使其在動(dòng)物組織中及奶制品中存在不同程度的殘留，人體長(zhǎng)期食用這些殘留有糖皮質(zhì)激素的食品會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂和發(fā)育異常等狀況[3-4]。另外有一些不法商販通過(guò)對(duì)一些保健品、中藥材等非法添加糖皮質(zhì)激素[5-7]，會(huì)使消費(fèi)者在食用后短期內(nèi)出現(xiàn)一些積極作用，但長(zhǎng)期攝入則可能會(huì)引起內(nèi)分泌失調(diào)、致畸、致癌、水腫、糖尿病等嚴(yán)重后果[8-9]。

隨著近年來(lái)人民生活水平在不斷提高，人們的飲食觀念也從注重食品數(shù)量向注重食品質(zhì)量轉(zhuǎn)變，食品安全既關(guān)系到人民群眾的切身健康也關(guān)系到我國(guó)食品行業(yè)的良性發(fā)展。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，不法商販非法濫用糖皮質(zhì)激素的情況不容樂(lè)觀[10-11]。在我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[12]對(duì)各類糖皮質(zhì)類激素進(jìn)行了最高限量值的規(guī)定，歐盟、日本等國(guó)際組織或國(guó)家也禁止對(duì)食品源性動(dòng)物使用糖皮質(zhì)類激素。現(xiàn)有常用的糖皮質(zhì)激素檢測(cè)方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[13-15]，這些方法均需要采樣后返回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)運(yùn)用大型設(shè)備儀器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)的便利性與時(shí)效性無(wú)法保證，建立一種快速、簡(jiǎn)單、可靠的檢測(cè)方法具有重要意義。

圖1 幾種常見(jiàn)的糖皮質(zhì)激素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of several common glucocorticoids

糖皮質(zhì)激素的種類多樣，常見(jiàn)的糖皮質(zhì)類激素包括氫化可的松、可的松、地塞米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索、倍他米松、潑尼松和潑尼松龍等。如圖1所示，幾種常見(jiàn)糖皮質(zhì)激素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖具有類似的母環(huán)結(jié)構(gòu)，也具有不同程度但作用相似的抗炎和促進(jìn)非正常生長(zhǎng)等作用。為應(yīng)對(duì)不法商家違規(guī)使用或添加不同種類糖皮質(zhì)激素的現(xiàn)象，除達(dá)到檢測(cè)方法的靈敏度外，也要求檢測(cè)方法具有一定廣譜特異性。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)基于異源策略的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可以顯著提高檢測(cè)小分子的靈敏度[16-23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選得到氫化可的松單克隆抗體，對(duì)12 種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行同源和異源包被的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA），為更好地應(yīng)對(duì)不同種類糖皮質(zhì)類激素殘留的檢測(cè)需求提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳樣品 中國(guó)伊利集團(tuán)；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存；6～8 周齡雄性SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、鑰孔戚血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 美國(guó)Sigma公司；免疫佐劑 北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸氟氫可的松、倍氯米松、倍他米松、乙酸地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；丙酸氯倍他索 中國(guó)Adamas-beta公司；可的松、曲安奈德、氫化可的松、地塞米松百靈威科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒湖南艾佳生物科技公司；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM-GlutaMAX）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉谷-氨酰胺混合液（100×）、HAT添加劑（50×）、HT添加劑（100×） 美國(guó)Gibco公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體 美國(guó)Arista Biologicals公司；ELISA酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：pH 7.4，0.2 g/L KH2PO4，2.9 g/L Na2HPO4·H2O，0.2 g/L KCl，8.5 g/L NaCl；PBST：含0.05% Tween 20的PBS；包被液：pH 9.6，0.75 g Na2CO3，1.46 g NaHCO3；封閉液：5%脫脂奶粉溶解于PBS。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyH1酶標(biāo)儀、96 孔酶聯(lián)免疫洗板機(jī) 美國(guó)BioTek公司；超純水機(jī) 美國(guó)Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 氫化可的松半抗原HYD及地塞米松半抗原DEX合成

氫化可的松半抗原HYD合成（圖2）：稱取氫化可的松0.18 g、丁二酸酐0.15 g于50 mL圓底燒瓶中，加入無(wú)水吡啶5 mL，混合后在60 ℃反應(yīng)8 h，停止加熱后冷卻至室溫，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至20 mL 10%的HCl冰水浴中，有大量白色沉淀析出，過(guò)濾后用去離子水洗滌數(shù)次，干燥后得半抗原白色固體約138 mg。

地塞米松半抗原DEX合成（圖2）：稱取地塞米松0.16 g、丁二酸酐0.12 g于50 mL圓底燒瓶中，加入無(wú)水吡啶5 mL，混合后在60 ℃反應(yīng)8 h，停止加熱后冷卻至室溫，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至20 mL 10%的HCl冰水浴中，有大量白色沉淀析出，過(guò)濾后用去離子水洗滌數(shù)次，干燥后得半抗原白色固體約130 mg。

圖2 氫化可的松半抗原HYD及地塞米松半抗原DEX合成Fig. 2 Synthesis of haptens from HYD and from DEX

1.3.2 完整抗原合成與鑒定

完整抗原參考活潑酯法[24]進(jìn)行合成，將氫化可的松半抗原HYD分別與載體蛋白KLH和OVA偶聯(lián)得到完整抗原KLH-HYD和OVA-HYD，地塞米松半抗原DEX與載體蛋白OVA偶聯(lián)得到OVA-DEX，其中合成的KLH-HYD作為小鼠的免疫抗原，OVA-HYD和OVA-DEX作為酶聯(lián)反應(yīng)的包被抗原，合成的完整抗原均采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定其質(zhì)量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合

選取8 只6～8 周齡雄性Balb/c小鼠，將KLH-HYD完整抗原稀釋至2 μg/μL，稀釋后的完整抗原與商品化佐劑按照1∶1比例振蕩混合均勻，吸取100 μL混合抗原對(duì)每只小鼠腿部進(jìn)行肌肉注射，第一次免疫后于第6、13天以同樣條件對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在第20天時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈取血，采用ic-ELISA方法檢測(cè)小鼠血清的親和力及特異性，選取血清效價(jià)1∶20 000以上中抑制率最高的小鼠進(jìn)行腹腔注射KLH-HYD完整抗原沖擊免疫，3 d后無(wú)菌提取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合[25]。

1.3.4 單克隆抗體的篩選與腹水制備

細(xì)胞融合10 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合率達(dá)100%，在融合第12天后，觀察大部分孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至約1/4孔底面積時(shí)對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)，后經(jīng)過(guò)多輪篩選驗(yàn)證及亞克隆，獲得1 株穩(wěn)定分泌抗氫化可抗體的細(xì)胞株（命名為HYD-C1）。利用HYD-C1細(xì)胞株誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生腹水，將獲得的腹水抗體通過(guò)辛酸硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化[26]，純化后產(chǎn)物分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 ic-ELISA的建立

使用棋盤(pán)法[27]分別確定同源策略（包被原為OVAHYD）和異源策略（包被原為OVA-DEX）下抗原及包被原的最佳工作質(zhì)量濃度。利用棋盤(pán)法中得到的最佳工作質(zhì)量濃度，以4 倍稀釋法制備不同質(zhì)量濃度的氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)液作為競(jìng)爭(zhēng)物，分別建立同源和異源策略氫化可的松ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)合率按照公式（1）計(jì)算：

式中：B為一定競(jìng)爭(zhēng)物氫化可的松質(zhì)量濃度時(shí)在450 nm波長(zhǎng)處的OD值；B0為不加任何抑制物時(shí)在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線以氫化可的松質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，當(dāng)結(jié)合率為50%時(shí)相應(yīng)的抑制物質(zhì)量濃度即為IC50值，以此評(píng)價(jià)其靈敏度，對(duì)比兩種不同策略下的檢測(cè)結(jié)果。

1.3.6 糖皮質(zhì)激素交叉抑制檢測(cè)

利用棋盤(pán)法優(yōu)化后得到的ic-ELISA工作條件，分別在包被同源抗原OVA-HYD及包被異源抗原OVA-DEX的情況下，采用4 倍稀釋法檢測(cè)得到的氫化可的松單克隆抗體對(duì)地塞米松、乙酸地塞米松、可的松、乙酸氟氫可的松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、倍氯米松、倍他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松11 種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行交叉抑制檢測(cè)，分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每種糖皮質(zhì)激素對(duì)應(yīng)半抑制濃度IC50值、檢測(cè)限IC10值，交叉反應(yīng)率根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中：IC50氫化可的松為抑制物為氫化可的松時(shí)的半抑制濃度/（ng/mL）；IC50目的抑制物為待測(cè)目的抑制物的半抑制濃度/（ng/mL）。

計(jì)算出每種糖皮質(zhì)激素對(duì)應(yīng)氫化可的松在同源及異源策略情況下的交叉反應(yīng)率，對(duì)比兩種策略下的氫化可的松單克隆抗體的廣譜特異性情況。

1.3.7 添加回收實(shí)驗(yàn)

將篩選出具有交叉反應(yīng)的糖皮質(zhì)激素分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，添加至正規(guī)超市中采購(gòu)的液體乳樣品中，首先使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測(cè)定出空白液體乳樣品中的待測(cè)的各糖皮質(zhì)激素含量，在此基礎(chǔ)上分別在液體乳中添加已知含量的各類糖皮質(zhì)激素，振蕩混勻，采用ic-ELISA，扣除空白樣品中本底值后計(jì)算各種糖皮質(zhì)激素的添加回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖像處理

利用Origin pro 2018及Excel等軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及分析數(shù)據(jù)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式由ChemBioDraw Ultra 14.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體最佳工作質(zhì)量濃度確定

基于棋盤(pán)法對(duì)OVA-HYD和OVA-DEX兩種包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度及純化后的抗體稀釋倍數(shù)進(jìn)行確定。確定工作質(zhì)量濃度如下：同源包被抗原OVA-HYD和異源包被抗原OVA-DEX的最佳工作質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，腹水抗體HYD-C1的最佳稀釋倍數(shù)為10 000 倍。

2.2 同源及異源策略ic-ELISA

圖3 同源（a）和異源（b）策略ic-ELISA法檢測(cè)氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curves for detection of hydrocortisone using homologous (a) and heterologous (b) ic-ELISA

根據(jù)優(yōu)化后的最佳抗原抗體工作質(zhì)量濃度，以4 倍稀釋法分別建立氫化可的松同源及異源策略ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，同源策略IC50氫化可的松為1.63 ng/mL；異源策略IC50氫化可的松為0.24 ng/mL。結(jié)果表明在異源策略中氫化可的松的靈敏度大幅高于同源策略中得到的結(jié)果。

2.3 糖皮質(zhì)激素交叉抑制檢測(cè)結(jié)果

表1 基于單克隆抗體建立的同源及異源策略ic-ELISA法對(duì)糖皮質(zhì)激素的靈敏度及交叉反應(yīng)率檢測(cè)結(jié)果Table 1 Cross-reactivity of monoclonal antibody against hydrocortisone with other glucocorticoids in homologous and heterologous ic-ELISA

如表1所示，在用OVA-HYD同源包被情況下，可的松、乙酸氟氫可的松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松、倍氯米松6 種糖皮質(zhì)激素有較明顯交叉抑制，交叉反應(yīng)率分別為38.6%、8.89%、70.78%、205.52%、2.52%和0.36%，剩余5 種糖皮質(zhì)激素的靈敏度IC50值均大于1×103ng/mL，無(wú)明顯交叉抑制情況；在OVA-DEX異源包被情況下，5 種在同源情況下無(wú)交叉抑制的糖皮質(zhì)激素也出現(xiàn)了明顯抑制情況，靈敏度范圍從0.19 ng/mL（乙酸氟氫可的松）到79.29 ng/mL（倍他米松），交叉抑制率范圍從0.3%（倍他米松）到126.32%（乙酸氟氫可的松）。結(jié)果表明，在同源和異源策略下該單克隆抗體都具有糖皮質(zhì)激素廣譜特異性，但在異源策略下對(duì)各種糖皮質(zhì)激素的靈敏度較之同源包被的情況發(fā)生了較大程度的提高，也具有更廣譜的糖皮質(zhì)激素抑制特征。

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 基于單克隆抗體建立異源策略ic-ELISA法對(duì)糖皮質(zhì)激素的添加回收檢測(cè)結(jié)果Table 2 Recoveries of spiked glucocorticoids by heterologous ic-ELISA

續(xù)表2

如表2所示，在異源策略中平均添加回收率在77.5%～111.3%之間，變異系數(shù)在1.2%～8.6%之間，結(jié)果表明異源策略ic-ELISA檢測(cè)的糖皮質(zhì)激素添加回收率落在合理范圍內(nèi)，符合檢測(cè)所需指標(biāo)，方法重復(fù)性較好、可以滿足于液體乳樣品中激素殘留的檢測(cè)需求。

3 結(jié) 論

本研究將氫化可的松半抗原HYD與KLH利用活潑酯法連接成完整抗原KLH-HYD使小鼠免疫，將HYD及地塞米松半抗原DEX分別與OVA連接成OVA-HYD和OVA-DEX完整抗原用作包被抗原，后取小鼠脾臟與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合篩選得到1 株穩(wěn)定分泌氫化可的松抗體的單克隆抗體，命名為HYD-C1，并利用該細(xì)胞株大量制備氫化可的松腹水抗體。以O(shè)VA-HYD作為同源包被源，以O(shè)VA-DEX作為異源包被源，利用得到的抗體分別建立同源策略及異源策略的氫化可的松ic-ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)在異源策略下的靈敏度（0.24 ng/mL）比同源策略下的（1.63 ng/mL）高出近1 個(gè)數(shù)量級(jí)。

利用該抗體在不同策略下進(jìn)行11 種糖皮質(zhì)激素的廣譜特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在異源策略下11 種糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)靈敏度均明顯提高，在同源策略下沒(méi)有明顯抑制的地塞米松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、乙酸地塞米松和倍他米松5 種糖皮質(zhì)激素均在異源策略下發(fā)生明顯抑制，說(shuō)明在異源策略中該抗體對(duì)應(yīng)的糖皮質(zhì)激素抑制譜更寬，靈敏度也更高。在異源策略下液體乳的糖皮質(zhì)激素添加回收實(shí)驗(yàn)中平均添加回收率在77.5%～111.3%之間，在合理范圍區(qū)間，重復(fù)性較好，本方法中對(duì)于氫化可的松、可的松、乙酸氟氫可的松、潑尼松和潑尼松龍的檢測(cè)限均能達(dá)到GB/T 21981—2008《動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中檢測(cè)低限，該方法的廣譜特異性可良好運(yùn)用于對(duì)液體乳樣品中糖皮質(zhì)激素殘留的現(xiàn)場(chǎng)初篩檢測(cè)。

本研究著重對(duì)比了氫化可的松抗體在同源策略與異源策略下對(duì)各種不同種類的糖皮質(zhì)激素的結(jié)合情況，推測(cè)存在異源包被的抗原在與抗體結(jié)合時(shí)的作用力要弱于同源包被時(shí)的情況，繼而使得游離抑制物可以更容易與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與抗體結(jié)合，使得許多在同源情況下不具備競(jìng)爭(zhēng)能力的糖皮質(zhì)激素在包被抗原結(jié)合力變?nèi)鯐r(shí)相對(duì)也具備了競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，但具體的分子作用力之間的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。異源策略大幅加強(qiáng)了抗體對(duì)具有類似結(jié)構(gòu)的其他糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)靈敏度，拓寬了糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)譜寬，這一策略可以更好地應(yīng)用于需要進(jìn)行廣譜篩查的日常檢測(cè)工作中，也為其他有提高靈敏度或提高廣譜特異性需求的研究提供參考。