孫思睿，萬 峰，趙鵬昊，侯雨佳，范小飄，梁 玉，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸桿菌的一種，常用作益生菌，廣泛存在于谷物、乳肉制品、果蔬制品及發(fā)酵飲料中，也常用于生產(chǎn)某些發(fā)酵產(chǎn)品，是一種重要的工業(yè)微生物。在食品生產(chǎn)中乳酸菌會面臨多種環(huán)境脅迫，如加工過程中的高壓脅迫[1]、發(fā)酵過程中的酸脅迫[2]以及貯藏過程中的冷脅迫[3]等，其中鹽脅迫也逐漸引起人們的關注。食鹽是泡菜、醬制品、發(fā)酵肉制品及干酪等發(fā)酵制品中必不可少的添加物，主要作用是調(diào)味和延長貯存期；然而一定濃度鹽會增加環(huán)境滲透壓，易使乳酸菌細胞失水，細胞質(zhì)濃縮，會在一定程度上影響其正常生理功能。因此，乳酸菌對鹽的耐受性在一定程度上會影響其發(fā)酵特性，對生產(chǎn)意義重大。

群體感應（quorum sensing，QS）是乳酸菌與外界環(huán)境進行信息交流的重要調(diào)控系統(tǒng)，通常由信號分子和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（包括組氨酸蛋白激酶和相應調(diào)節(jié)因子）兩部分組成。AI-2是一類重要的信號分子，可以進行細菌間的溝通，其中LuxS蛋白酶是AI-2合成的關鍵酶，因此其編碼基因luxS在QS系統(tǒng)中具有重要作用[4]。當信號分子的濃度達到一定閾值后，便會激活特定基因的表達，以調(diào)控某個單個細菌無法完成的生理功能[5]，如生物發(fā)光[6]、生物膜形成[7]、細菌素的合成[8]、耐受性[9]及黏附性[10]等。luxS介導的QS過程已被證明可以調(diào)節(jié)基因表達[11]，且該基因序列高度保守，當前研究發(fā)現(xiàn)luxS基因與耐酸能力有很大關系，但對細菌素合成及鹽耐受性的影響知之甚少。

L. plantarum KLDS1.0391是從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的1 株生理特性良好的產(chǎn)細菌素菌株，由全基因組信息得知[12]，該菌具有多種與脅迫相關的蛋白，包含5 個膽鹽脅迫相關基因、13 個溫度脅迫相關基因以及4 個滲透壓脅迫相關基因等。前期研究結(jié)果證實該菌含有l(wèi)uxS基因[13]；并已發(fā)現(xiàn)：QS可調(diào)節(jié)該菌與其他細菌共培養(yǎng)時細菌素的合成[13]，但還不清楚該菌鹽脅迫耐受性是否受QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)。

本研究通過測定野生株和luxS基因缺失突變株在不同濃度鹽脅迫下的生長及細菌素合成情況，探究luxS基因在L. plantarum KLDS1.0391應對NaCl脅迫時的作用，從而揭示在NaCl脅迫時L. plantarum中QS系統(tǒng)對該菌株生長及代謝的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

L. plantarum KLDS1.0391野生株及l(fā)uxS基因缺失突變株均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC6633 中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制方法參照文獻[14-15]。

氯霉素（chloramphenicol，CAP）、溶菌酶 美國Amresco公司；PrimerScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、DL5000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌總RNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶 天根生化科技有限公司；瓊脂糖、過氧化氫酶 美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生化純。

1.2 儀器與設備

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；0.22 μm微孔濾膜 美國Bio-Rad公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；ZHWY200B型全溫度恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-8D型全自動高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；9700 PCR擴增儀 美國Applied Biosystem公司；Step One PlusTM實時熒光定量PCR儀 美國Thermo Fisher公司；LGJ-1冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多有限公司；UV-2401PC型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 luxS基因缺失突變株的構(gòu)建與擴培

參照文獻[16]，并對構(gòu)建成功的突變株進行氯霉素抗性平板及PCR擴增驗證。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸210 s，33 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。分別將L. plantarum KLDS1.0391野生株及l(fā)uxS基因缺失突變株于MRS及含氯霉素的MRS培養(yǎng)基中37 ℃活化3 代，進行之后實驗。

1.3.2 鹽耐受能力比較

將活化后的野生株和突變株過夜培養(yǎng)，分別取10 mL菌液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌2 次后等體積重懸于含0%、2%、3%、4%、6%以及8% NaCl的磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃孵育24 h，分別測定在孵育0、8、16 h和24 h時2 株菌的活菌數(shù)，并按下式計算存活率：

1.3.3 生長性能比較

分別將野生株和突變株以2%的接種量接種于含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，每隔4 h取樣，在波長600 nm處測定OD值，并繪制生長曲線。

1.3.4 產(chǎn)細菌素能力比較

在1.3.3節(jié)取樣間隔，每個樣品取10 mL菌液，12 000 r/min離心15 min收集無細胞發(fā)酵上清液，按參考文獻[17]采用雙層平板打孔法測定抑菌活性，以B. subtilis作為上層指示菌，打孔后上樣量為100 μL。

1.3.5 部分基因表達的比較

1.3.5.1 PCR引物設計與合成

以16S rDNA作為內(nèi)參基因，目的基因為細菌素結(jié)構(gòu)基因plnEF以及QS調(diào)節(jié)基因plnD和plNC8HK。引物設計見表1[18]。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.3.5.2 總RNA提取

分別將野生株與突變株在含0%、2%及4% NaCl的MRS中培養(yǎng)24 h后，取菌液（要求所收集菌體數(shù)量小于1×109CFU/mL）于4 ℃、12 000 r/min離心2 min，棄上清液收集菌體。RNA提取過程參照天根細菌總RNA提取試劑盒（DP430）說明書，分別提取上述菌體的總RNA。

1.3.5.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

首先在反轉(zhuǎn)錄前去除基因組DNA，然后在冰浴上按PrimerScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書混合體系并合成cDNA，合成后于4 ℃保存。

1.3.5.4 實時熒光定量PCR檢測

依據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行PCR反應液的配制。反應體系總體積為20 μL。PCR參數(shù)為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，共40 個循環(huán)數(shù)[16]。在任一鹽濃度脅迫下，均以野生株樣品為校準樣品，以同濃度下luxS基因突變株樣品為待測樣品，通過2-ΔΔCt分析不同待測樣品基因的表達差異[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果均為3 次獨立重復實驗數(shù)據(jù)的平均值，用 ±s表示。采用Excel及Origin 8.5進行數(shù)據(jù)分析和作圖，并利用SPSS 17.0程序進行方差分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 luxS基因缺失突變株的驗證

前期研究已經(jīng)成功構(gòu)建luxS基因缺失突變株[16]，由于質(zhì)粒自身性質(zhì)不穩(wěn)定且基因敲除后具有一定復原性，在長時間貯存后性狀易發(fā)生改變，因此在實驗前對突變株進行驗證。在含4 mg/L CAP的抗性平板上劃線結(jié)果顯示，野生株在抗性平板上不生長，而luxS基因缺失突變株正常生長（圖1）。

圖1 luxS基因缺失突變株抗性平板驗證Fig. 1 Verification of luxS gene deletion mutant strain by resistant plate

分別挑取抗性MRS平板上生長的突變株單菌落及普通MRS平板上生長的野生株單菌落進行PCR驗證，結(jié)果顯示，野生株在2.9 kb處有一條明亮條帶為luxS基因片段（圖2泳道1），而突變株分別在2.9 kb和3.4 kb處有兩條明亮的特異性條帶（圖2泳道2）。由于L. plantarum KLDS1.0391具有2 個luxS基因片段，突變株的2 條特異性條帶分別為同源重組的轉(zhuǎn)化子與luxS基因片段，表明打靶片段仍同源重組在基因組中，因此該突變株為L. plantarum KLDS1.0391 luxS單基因缺失突變株。

圖2 luxS基因缺失突變株菌落PCR驗證Fig. 2 Verification of luxS gene deletion mutant strain by PCR

2.2 luxS基因?qū)闚aCl耐受能力的影響

在6 種不同質(zhì)量分數(shù)NaCl脅迫條件下，L. plantarum KLDS1.0391野生株與luxS基因缺失突變株在脅迫24 h內(nèi)存活率的變化如圖3所示。在孵育過程中，無論luxS基因缺失與否，L. plantarum KLDS1.0391存活率均隨NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高而降低，且野生株對NaCl具有較好的耐受能力，在8% NaCl質(zhì)量分數(shù)下脅迫24 h后存活率仍能達到80%以上。

圖3 NaCl脅迫對野生株與luxS基因缺失突變株存活率的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of NaCl stress on survival rates of the wild-type strain and its mutant

不添加NaCl時，在孵育的24 h中，兩株菌的存活率均有微弱下降，這可能是由于沒有營養(yǎng)物質(zhì)導致其中某些細胞個體的衰亡（圖3a）。在2% NaCl條件下孵育24 h后，存活率低于不添加NaCl組，但兩株菌存活率仍能達到98%以上，且無顯著性差異（P＞0.05）（圖3b），此結(jié)果表明：在NaCl質(zhì)量分數(shù)低于2%時，luxS基因?qū)υ摼昴褪躈aCl脅迫的影響不顯著。當NaCl質(zhì)量分數(shù)不小于3%時，野生株對NaCl的耐受能力極顯著高于突變株（P＜0.01）。野生株在3%、4%、6%及8% NaCl質(zhì)量分數(shù)下脅迫24 h后存活率分別為97.95%、95.55%、95.10%和83.47%；而luxS基因缺失突變株的存活率分別為92.05%、89.13%、75.15%和67.46%（圖3c～f），實驗結(jié)果表明，luxS基因在L. plantarum菌株耐受NaCl脅迫中起作用。

2.3 luxS基因?qū)暝贜aCl脅迫下生長的影響

由鹽耐受能力實驗結(jié)果可知，在8% NaCl質(zhì)量分數(shù)脅迫下菌株存活率顯著下降，表明該條件嚴重影響其存活能力，進而抑制菌株生長代謝，因此在后續(xù)研究中僅討論其他5 個質(zhì)量分數(shù)梯度。由圖4可知，無論是野生株還是突變株，鹽脅迫均會在一定程度上延緩或抑制L. plantarum KLDS1.0391菌體的生長。野生株在含2%NaCl的MRS中生長16 h后進入穩(wěn)定期（圖4b），較不含NaCl延遲4 h（圖4a），但在穩(wěn)定期后的OD600nm值無顯著差異（P＞0.05）；而對于其他NaCl質(zhì)量分數(shù)，不僅到達穩(wěn)定期的時間較不含NaCl時有所延遲，OD600nm值也顯著降低（P＜0.05）（圖4c～e）。對于luxS突變株，任何質(zhì)量分數(shù)的NaCl脅迫均會延長其進入穩(wěn)定期的時間，且顯著降低菌體數(shù)量（P＜0.05）；生長能力均弱于野生株，且差異顯著（P＜0.05）。而突變株相對于野生株而言，二者達到各生長階段的時間幾乎保持一致，無延遲現(xiàn)象；但在達到穩(wěn)定期后，各NaCl質(zhì)量分數(shù)下活菌數(shù)均為野生株大于突變株。在6% NaCl質(zhì)量分數(shù)下，菌株在指數(shù)生長階段維持較長時間，表明高質(zhì)量分數(shù)NaCl脅迫嚴重影響了L. plantarum KLDS1.0391的生長。野生株在含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)進入穩(wěn)定期后OD600nm值分別為1.767、1.766、1.657、1.588和1.182；突變株則分別為1.705、1.677、1.618、1.544、1.101。

圖4 NaCl脅迫對野生株與luxS基因缺失突變株生長的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of NaCl stress on growth of the wild-type strain and its mutant

2.4 luxS基因缺失對菌株在NaCl脅迫下細菌素合成能力的影響

隨著L. plantarum KLDS1.0391進入生長對數(shù)期，野生株細菌素合成量逐漸增加，當進入穩(wěn)定期后細菌素合成量最大，且隨著細菌的衰亡，細菌素合成能力也逐漸減弱（圖5a）；在2% NaCl脅迫下，細菌素合成量高于未添加NaCl（圖5b）；而當NaCl質(zhì)量分數(shù)大于2%時，則在一定程度上抑制細菌素的合成，NaCl脅迫下L. plantarum KLDS1.0391細菌素最大合成量的順序依次為：2% NaCl＞0% NaCl＞3% NaCl＞4% NaCl＞6% NaCl（圖5c～e）。對于突變株，雖然細菌素在菌體生長過程中的合成趨勢與野生株相同，但是當其面對NaCl脅迫時，細菌素合成能力均較未脅迫時有所降低，且隨NaCl質(zhì)量分數(shù)提高，細菌素合成量也逐漸下降，差異顯著（P＜0.05）。

圖5 NaCl脅迫對野生株與luxS基因缺失突變株細菌素合成的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of NaCl stress on bacteriocin biosynthesis of the wild-type strain and its mutant

2.5 luxS基因?qū)暝贜aCl脅迫下細菌素合成相關基因表達的影響

圖6 NaCl脅迫對野生株與luxS基因缺失突變株細菌素相關基因表達的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of NaCl stress on expression of bacteriocin biosynthesis-related genes in the wild-type strain and its mutant

根據(jù)上述細菌素合成能力研究結(jié)果，選取具有代表性的促進細菌素合成的NaCl質(zhì)量分數(shù)2%、抑制細菌素合成的NaCl質(zhì)量分數(shù)4%為研究對象，以未脅迫作為對照。結(jié)果表明：當L. plantarum野生株及突變株分別在不含NaCl的MRS中培養(yǎng)24 h時，編碼細菌素的結(jié)構(gòu)基因plnEF與調(diào)節(jié)細菌素合成相關基因plnD和plNC8HK表達量差異不顯著（P＞0.05）（圖6a）；當NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%和4%時，luxS基因缺失導致基因plnEF、plnD和plNC8HK的表達量極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖6b、c）。結(jié)果表明，存在鹽脅迫時，luxS基因會影響L. plantarum KLDS1.0391中細菌素合成相關基因的轉(zhuǎn)錄水平，進而影響該菌在鹽脅迫條件下細菌素的合成。

3 討 論

許多發(fā)酵食品如發(fā)酵肉、酸菜、干酪等通常會在發(fā)酵過程中添加一定量的NaCl，使得環(huán)境中的滲透壓升高，影響細胞結(jié)構(gòu)并引起生理損傷，這會在一定程度上對乳酸菌的生長與代謝造成脅迫。從本實驗結(jié)果可以看出，無論野生株亦或是luxS基因缺失突變株，隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加，存活率均逐漸下降，這是由于當環(huán)境滲透壓增大時，細胞中的K+和Na+含量不足，細胞失水無法維持正常平衡，當水分活度降低到一定程度導致死亡[20]；而在較低NaCl質(zhì)量分數(shù)下仍能維持較高的存活率可能因為調(diào)節(jié)因子如分子伴侶（GroEL、GroES、DnaK、DnaJ等），在面對環(huán)境脅迫時，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的修復和折疊，以及甘氨酸甜菜堿等相似相容性物質(zhì)，取代水與生物大分子物質(zhì)結(jié)合，減少細胞失水，從而對細菌自身起到良好的保護作用[21]。

LuxS/AI-2 QS可以調(diào)控乳酸菌的多種代謝活動，luxS是合成AI-2信號分子中重要酶的編碼基因，在調(diào)控中起著重要作用。當luxS基因缺失時，L. plantarum KLDS1.0391對NaCl的耐受能力及NaCl脅迫下的生長能力均較野生株顯著下降，表明luxS基因?qū)aCl脅迫抗性起重要作用。Gu Yue等[22]研究表明當Lactobacillus fermentum 2-1在4.5% NaCl脅迫下生長時，luxS基因及pfs基因的表達量分別上調(diào)4.2 倍和2.9 倍，表明luxS基因在面對NaCl脅迫時起到一定的積極調(diào)節(jié)作用；此外Lin Lin等[23]也通過研究表明當luxS基因被破壞后，會抑制調(diào)節(jié)因子dps-1基因的表達，致使菌體無法抵抗環(huán)境壓力；同樣Van Kessel等[24]發(fā)現(xiàn)AI-2 QS系統(tǒng)參與了哈氏弧菌的滲透脅迫反應系統(tǒng)，且滲透耐受系統(tǒng)甘氨酸甜菜堿操縱子betIBA-proXWV由群體信號誘導，因此與野生型相比，信號調(diào)節(jié)基因luxR缺陷型菌株抗性較弱。然而Park等[25]研究雖然也證明了LuxS/AI-2 QS信號對Escherichia coli O157：H7應對滲透脅迫有一定作用，但是其結(jié)果表明在0.6 mol/L NaCl脅迫條件下，luxS缺陷型大腸桿菌生長速率快于野生株，且對滲透脅迫耐受性強，這可能是由于luxS基因的缺失影響大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控，改變了甲硫氨酸生物合成途徑；同時rcsA可以激活多糖的合成，且該基因與sdiA（一種編碼AHLs QS調(diào)節(jié)因子LuxR的同源物質(zhì)基因）的表達相關，因此推測rcsA基因的表達差異可能是影響二者生理反應的主要原因。近年來，關于luxS/AI-2 QS參與應激反應[26]的研究逐步增加，Lebeer等[27]研究表明Lactobacillus rhamnosus的luxS突變株在模擬胃液中的存活率下降，表明luxS基因?qū)ξ杆釕て痍P鍵作用；L. acidophilus的luxS突變株由于無法產(chǎn)生AI-2信號分子，使得生物膜的合成能力受到嚴重影響，且對腸上皮細胞的黏附性僅為野生株的42%[28]。

細菌素是由核糖體合成的具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽，可以抑制某些同源微生物的生長，可作為新型防腐劑或抑菌物質(zhì)。野生株在2% NaCl質(zhì)量分數(shù)下培養(yǎng)至穩(wěn)定期后細菌素活性較對照組顯著提高，而其他質(zhì)量分數(shù)時細菌素活性則顯著降低，這與Lim[29]的結(jié)論相似，L. plantarum KC21在低濃度NaCl脅迫下對細菌素合成有一定促進作用。然而當面對環(huán)境中的NaCl脅迫時，不同菌株也有差異，如Lactobacillus casei CTC494在有NaCl脅迫的條件下細菌素活性均下降[30]；而Lactobacillus pentosus B96在8%質(zhì)量濃度NaCl脅迫時細菌素活性仍較正常培養(yǎng)時有所升高[31]。但對于相關機制目前尚未有明確定論，這可能由于適量NaCl可以改變細胞膜的通透性[32]，有利于細菌素的釋放；同時細菌素的分泌有多種途徑如Sec途徑、SRP途徑以及ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等，一定濃度NaCl脅迫下可能使得相關基因的表達量發(fā)生改變[33]，增加了細胞分泌的效率，使得合成的細菌素更快的排出胞內(nèi)被檢測到相關活性。Man等[18]研究結(jié)果顯示，L. plantarum KLDS1.0391中含有一對組氨酸蛋白激酶plNC8HK與相應調(diào)節(jié)因子plnD，并構(gòu)建了plNC8HK-plnD基因突變株，發(fā)現(xiàn)突變株在單獨培養(yǎng)時無細菌素活性檢出，這表明該雙組分系統(tǒng)對細菌素的合成具有重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明luxS基因缺失突變株在各NaCl質(zhì)量分數(shù)脅迫下細菌素活性低于野生株，說明luxS基因顯著影響細菌素的合成，且進一步實時熒光定量結(jié)果表明，突變株中與細菌素合成相關基因plnD、plnEF及plNC8HK基因的表達量均低于野生株。Merritt等[34]研究發(fā)現(xiàn)luxS基因缺失使得Streptococcus突變株無法產(chǎn)生細菌素mutacin I，且編碼基因mutA的表達量也較野生株下調(diào)400多倍，位于操縱子下游基因的正調(diào)控基因mutR的表達量也顯著下調(diào)，同樣表明luxS基因?qū)毦睾铣捎兄匾饬x。

細菌素作為生物防腐劑使用時，應具備在鹽脅迫條件下有較好的生長與細菌素合成能力。本研究表明：L. plantarum KLDS1.0391野生株具有較好的鹽耐受能力，在8% NaCl質(zhì)量分數(shù)脅迫下仍能保持80%以上的存活率，且在低質(zhì)量分數(shù)NaCl存在時可以顯著提高細菌素合成能力；當luxS基因缺失時，其對高質(zhì)量分數(shù)NaCl的耐受能力顯著降低，且在任一NaCl質(zhì)量分數(shù)脅迫下突變株的生長能力、細菌素合成能力均弱于野生株，細菌素合成相關基因的表達量也均顯著下降，說明L. plantarum KLDS1.0391中的luxS基因參與鹽脅迫響應且起著重要作用，這為脅迫下QS調(diào)控細菌素合成提供一定理論依據(jù)，同時為該菌株應用于實際生產(chǎn)提供理論支持。