吳金勇，陳祥松，余 超，陸姝歡，李翔宇,,*，姚建銘,3,,*

（1.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院，安徽 合肥 230031；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學技術(shù)大學，安徽 合肥 230026；4.武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430073；5.湖北省營養(yǎng)化學品生物合成工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223）

聚唾液酸（polysialic acid，PSA）是由唾液酸單體以α-(2,8)和/或α-(2,9)鍵連接的聚合體[1-2]，唾液酸單體又稱為N-乙酰神經(jīng)氨酸。PSA在哺乳動物中具有重要的生理功能：參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[3-4]、維持神經(jīng)系統(tǒng)健康[5]、參與癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]、參與細胞內(nèi)外分子間相互作用[3]。PSA還具有抗黏附功能，可促進哺乳動物外壁器官（如肺、肝、睪丸和胎盤）的發(fā)育、修復和再生[5,8-9]。PSA也是一種非免疫原性、可生物降解的材料，可用于組織工程和藥物緩釋材料[8-9]。此外，PSA降解后的唾液酸單體已被證實是人類大腦認知發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一[10]，食用含唾液酸單體的食物可增加腦神經(jīng)節(jié)苷和糖蛋白的濃度[11]，也可增強早期的學習能力[12-14]，母乳中含有大量唾液酸[10]，因此可能對嬰兒早期的腦神經(jīng)發(fā)育有非常重要的作用[15]。在嬰幼兒奶粉配方領(lǐng)域具有潛在較大的市場。

隨著PSA被關(guān)注度的提高，國內(nèi)外有許多單位研究開發(fā)PSA生產(chǎn)工藝，Wu Jianrong等[12]采用較低水平的初始磷酸鹽，并控制發(fā)酵過程中pH值為6.4，最終PSA產(chǎn)量達到5.2 g/L，比初始產(chǎn)量提高了52.9%。Zheng Zhiyong等[13]采用雙階段pH值控制的策略：第1階段pH值控制在6.4，以促進細胞生長和形成PSA，第2階段pH值控制在7.4，促進形成較高分子質(zhì)量的PSA，最終得到PSA產(chǎn)量達到5.65 g/L，比對照提高了2 倍。Chen Fang等[14]利用基因工程手段加強PSA合成途徑中關(guān)鍵酶的表達并敲除競爭性途徑中的相關(guān)基因，從而獲得高產(chǎn)PSA的工程菌，在7 L發(fā)酵罐中PSA產(chǎn)量高達16.15 g/L。從以上研究結(jié)果來看，對PSA發(fā)酵過程優(yōu)化可有效提高其產(chǎn)量，但最終產(chǎn)率還是較低。采用基因工程手段改造生產(chǎn)菌種效果非常顯著，然而轉(zhuǎn)基因微生物所生產(chǎn)的食品或食品添加劑并不被市場和消費者所接受。離子束注入誘變技術(shù)是20世紀80年代我國科學家Yu Zengliang等[16]提出，并迅速在生物工程領(lǐng)域得到應(yīng)用的一項新技術(shù)[17-18]，該技術(shù)采用較低能量的氮離子注入，可誘導微生物體內(nèi)染色體畸變、DNA多態(tài)性變化等[17]。離子束注入由于正突變率高且不涉及轉(zhuǎn)基因操作，已被業(yè)內(nèi)廣泛使用且相應(yīng)產(chǎn)品也被市場所接受。例如，張麗敏等[19]通過離子束注入誘變，獲得1 株突變株，PSA產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了0.3 g/L。在工藝優(yōu)化方面，呼吸商（respiration quotient，RQ）在線實時調(diào)控策略在紅霉素、谷胱甘肽發(fā)酵優(yōu)化及放大中獲得成功應(yīng)用[20-21]，而目前PSA發(fā)酵工藝優(yōu)化主要是圍繞pH值、前體或無機鹽等方向開展，在線實時調(diào)控僅限于pH值、溶氧等手段。RQ能反映微生物代謝實時情況[20-21]，因此有必要在PSA的發(fā)酵工藝研究中開發(fā)RQ在線實時調(diào)控策略以指導PSA的中試放大及生產(chǎn)。鑒于以上情況，要對現(xiàn)有菌株進一步進行離子束誘變以獲取高產(chǎn)PSA的生產(chǎn)菌株，同時配套開發(fā)RQ在線實時調(diào)控PSA生產(chǎn)以推進PSA的產(chǎn)業(yè)化進程。

本研究采用低能氮離子束注入誘變獲取不同產(chǎn)量的變異菌株，并研究不同產(chǎn)量的菌株發(fā)酵過程中RQ的變化趨勢，從而得到PSA和RQ之間的初步規(guī)律，進而采用脈沖式補入玉米漿干粉以確定RQ變化的規(guī)律，根據(jù)該規(guī)律，制定不同RQ調(diào)控玉米漿干粉補料策略，在提高生物量的同時進一步提高PSA的產(chǎn)量，最終實現(xiàn)了PSA的高產(chǎn)，為PSA產(chǎn)業(yè)化提供了理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli ATCC13027），購于美國組織培養(yǎng)庫。

硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂均為國產(chǎn)分析純；胰蛋白胨、酵母浸粉 美國Oxoid公司；玉米漿干粉山東振華生物科技有限公司；氨水 泰興市蘇榮助劑廠；葡萄糖 嘉吉生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C潔凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；FiveEasy S20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZH-100KBS立式大型滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；氮離子注入裝置 中國科學院等離子體物理研究所；BIOTECH-50JSA全自動機磁力攪拌發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；PS7000尾氣分析儀 德國H&B品牌重慶川儀九廠組裝；ZHWY-211C臥式恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；SBA-40C葡萄糖分析儀 中國山東科學院生物研究所；Ultimate3000高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.2～7.4。將保存于4 ℃冰箱的菌種，挑取1 環(huán)到準備好的固體斜面培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)12 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉3.0 g/L，pH 7.2～7.4。將斜面培養(yǎng)活化后的種子接種兩環(huán)于250 mL三角瓶中（內(nèi)裝50 mL 種子培養(yǎng)基）后，放置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為轉(zhuǎn)速250 r/min，溫度37 ℃，培養(yǎng)8～10 h。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，玉米漿干粉20 g/L，硫酸銨3 g/L，磷酸二氫鉀7 g/L，硫酸鎂1 g/L，金屬離子1 mL/L，維生素溶液1 mL/L，pH 7.5（滅菌前）。將活化后的種子液按10%接種量接于250 mL三角瓶中（內(nèi)裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基）后，放置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為：轉(zhuǎn)速350 r/min，溫度37 ℃，培養(yǎng)72 h，每培養(yǎng)12 h補入葡萄糖1 g，共計補入5 次。

1.3.4 離子束誘變

大腸桿菌按照1.3.2節(jié)種子培養(yǎng)方法，培養(yǎng)結(jié)束后10 000 r/min離心5 min，取下層菌體重懸于等體積的無菌生理鹽水中。經(jīng)離心、重懸2～3 次，制得菌懸液，進行梯度稀釋，選擇合適梯度的菌懸液涂布于無菌平皿，在超凈臺中以無菌空氣風干備用。離子注入實驗在中科院離子束生物工程學重點實驗室氮離子注入裝置上進行。N+離子源注入注入能量15 keV，注入劑量1×1014～12×1014ion/cm2，以5 s脈沖式注入，間隔20 s，靶室真空度約10-3Pa。將每兩個涂布平皿上下疊放于注入機靶臺上，上層接受離子者為處理，下層未接受離子注入者為真空對照。每個劑量進行3 組平行實驗，通過預實驗確定存活率，按存活率決定稀釋倍數(shù)，以每平板菌落100～300 個為宜，誘變結(jié)束后以2 mL無菌水洗脫，梯度稀釋后，涂布于含有斜面培養(yǎng)基的平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用于單菌落的挑選及致死率計算，如式（1）所示：

1.3.5 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

全自動50 L磁力攪拌發(fā)酵罐中裝30 L發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子按照10%的接種量接入發(fā)酵罐中。在溫度37 ℃、通氣量60～90 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速300～500 r/min條件下培養(yǎng)時間60 h。溶氧全程控制在30%以上。通過自動流加氨水維持發(fā)酵液pH值在6.8±0.02以內(nèi)。全程流加600 g/L的葡萄糖液以補充碳源，每4 h取樣檢測發(fā)酵液殘?zhí)?，計算葡萄糖消耗速率，根?jù)葡萄糖實際消耗速率進行控制，發(fā)酵液殘?zhí)强刂撇怀^0.2 g/L。

1.3.6 生物量測定

取20 mL發(fā)酵液樣品，10 000 r/min離心5 min，取下層菌體，置于105 ℃烘箱2 h至質(zhì)量恒定，稱取質(zhì)量，將菌體干質(zhì)量除以樣品體積，即得到生物量。

1.3.7 還原糖測定

用葡萄糖分析儀測定發(fā)酵液殘余葡萄糖含量。

1.3.8 PSA含量的測定

對PSA含量的測定采用間苯二酚法。

標準曲線制作：取100 mg/L唾液酸標準品0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL于各管中，補水至2.0 mL為標準曲線各點。各管加2 mL顯色劑（0.l mol/L硫酸銅溶液0.5 mL，4%間苯二酚溶液5 mL，濃鹽酸80 mL，補水至100 mL混勻，臨用現(xiàn)配）搖勻，沸水浴60 min后冰浴10 min，每管加4 mL有機相（正丁醇15 mL，加乙酸丁酯定容至100 mL），充分搖勻后置室溫10 min，取上層有機相，以0 mL對照為零點，于585 nm波長處測定吸光度，并作線性回歸。

樣品分析：發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min取上清液0.1 mL，按照制作標準曲線的方法處理該樣品，最后在585 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中PSA含量。

1.3.9 乙酸含量的測定

發(fā)酵液離心后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后采用高效液相色譜測定，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；流動相為5 mmol/L硫酸，流動相流速0.6 mL/min；紫外檢測器，波長200 nm；柱溫60 ℃；進樣量20 μL。

1.3.10 OUR、CER和RQ的測定

測定尾氣中氧氣含量（O2out）和二氧化碳含量（CO2out），并結(jié)合發(fā)酵過程通氣量/發(fā)酵培養(yǎng)體積比（VVMin）計算氧消耗速率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）和RQ，通氣量采用熱式質(zhì)量流量計測定，顯示值已經(jīng)換算成標準狀況下的數(shù)值（273.15 K，101 kPa）。OUR、CER和RQ計算如式（2）～（4）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖像處理

每個實驗共設(shè)3 個平行，采用SPSS 17.0軟件進行方差顯著性分析，選擇獨立樣本t檢驗。圖表采用Excel 2007軟件進行制作分析，并采用Adobe Photoshop CS5處理后輸出；發(fā)酵培養(yǎng)過程中，OUR、CER、RQ每30 min取一個點，采用Excel 2007軟件制作分析并采用Adobe Photoshop CS5處理后輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能N+離子束對菌體的致死率

表1 不同N＋離子束下大腸桿菌的致死率Table 1 Mortality rates of E. coli under different doses of N+ ion beam

如表1所示，在一定范圍內(nèi)，隨著離子束誘變劑量的提高，大腸桿菌致死率隨之迅速增加，當劑量超過6×1014ion/cm2時，致死率反而下降，當劑量增加至10×1014ion/cm2時，致死率與6×1014ion/cm2劑量的致死率接近，當劑量進一步增加至12×1014ion/cm2時，致死率達到95%。致死率的先提高后下降再提高的現(xiàn)象在其他文獻中也有報道，為取得較好的正突變率，一般選擇致死率的平臺期[22-23]。因此，誘變劑量選擇10×1014ion/cm2。

2.2 突變株搖瓶復篩

對平板法篩選到的146 株菌進行250 mL搖瓶發(fā)酵復篩。結(jié)果表明，25 株突變株較出發(fā)菌株P(guān)SA產(chǎn)量有所提高，正突變率為17.1%。PSA產(chǎn)量提高最多的5 株正突變株以及PSA產(chǎn)量出現(xiàn)下降的6 株搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，相對出發(fā)菌株來說，N149菌株P(guān)SA產(chǎn)量增加率最大，為36.81%，而N164菌株P(guān)SA產(chǎn)量下降最多，下降率為22.92%。因而選擇出發(fā)菌株、N149和N164菌進一步研究，以了解3 株菌之間的差異。

表2 復篩得到11 株菌的搖瓶考察結(jié)果Table 2 Results of secondary screening of the 11 strains by in shake flask fermentation

2.3 不同突變株在發(fā)酵過程中生物量、PSA、RQ、乙酸變化趨勢

通過離子束注入誘變得到了正突變和負突變的菌種，其PSA產(chǎn)量與對照的差異從-22.92%波動至36.81%，離散系數(shù)（標準差/平均值）達到21.56%，為研究大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)PSA過程中的關(guān)鍵控制點，分別從突變株中選取產(chǎn)量最高的正突變株N149和產(chǎn)量最低的負突變株N164在50 L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵，并以出發(fā)菌株為對照。從而研究比較3 株不同PSA產(chǎn)量菌株之間的差異。

圖1 不同突變株在發(fā)酵過程中生物量（A）、乙酸（B）、PSA（C）及RQ（D）變化趨勢Fig. 1 Time courses of dry biomass yield (A), acetic acid (B),PSA titer (C) and RQ (D) in fed-batch fermentation by E. coli

由圖1A可知，出發(fā)菌株在42 h獲得最大生物量，為49.30 g/L。N149和N164在48 h時分別達到48.6 g/L和41.3 g/L。出發(fā)菌株和N149最終生物量相同，而N164生物量整體偏低。3 個菌株生物量趨勢的共同特點是在48 h后不再增長，反而呈現(xiàn)下降趨勢。Zheng Zhiyong等[13]在研究大腸桿菌產(chǎn)PSA的工藝時發(fā)現(xiàn)，生物量在20 h左右可達到最高點，隨后開始出現(xiàn)下降趨勢，該研究采取兩階段pH值調(diào)控的策略后，菌體生物量可持續(xù)增長至40 h。在Wu Jianrong等[24]的研究中，大腸桿菌生物量在36 h達到最大值，38 h時生物量就開始下降，通過添加磷酸二氫鉀以及氨水結(jié)合氫氧化鉀控制pH值后，生物量提高了約40%，并在42 h達到最高之后一直穩(wěn)定到58 h才出現(xiàn)下降趨勢。從這些研究來看，產(chǎn)PSA的大腸桿菌按照常規(guī)發(fā)酵工藝進行調(diào)控可能會較快進入衰亡期，因此大部分研究都會適當調(diào)整不同的策略控制工藝以保持菌體的活力，從而延長PSA的生產(chǎn)期。圖1B顯示，N164乙酸質(zhì)量濃度最高，其次為出發(fā)菌株，最低的為N149。由圖1C可看出，20 h前3 株菌PSA產(chǎn)量比較接近，20 h后3 株菌的PSA產(chǎn)量增長趨勢出現(xiàn)差異，42 h時N164、出發(fā)菌株和N149的PSA產(chǎn)量差異最大，分別為3.26、5.45、8.52 g/L，3 株菌PSA產(chǎn)量差異極顯著（P＜0.01），發(fā)酵結(jié)束時，N164、出發(fā)菌株和N149的PSA最大產(chǎn)量分別為4.06、6.79、9.05 g/L，PSA生產(chǎn)速率分別為67.6、113.2、150.9 mg/（L·h）。由圖1D可以看出，較優(yōu)的突變株N149在0～18 h RQ維持在1.0上下波動，12～48 h RQ保持在0.7左右，而另外兩株保持在1.0左右，并且PSA產(chǎn)量差異也較大，可以推測，PSA高速合成時，RQ最佳值可能就在0.7左右，由此看來，RQ值可能直接表征PSA的合成狀態(tài)。此外，高產(chǎn)菌株在48 h后出現(xiàn)RQ回升的趨勢，PSA產(chǎn)量在此之后并無增長。

3 株菌生物量、PSA以及乙酸產(chǎn)生量均有較大的差異，發(fā)酵工藝保持一致的情況下，可以推測這些差異是由于菌種本身所造成的。RQ作為很好的在線調(diào)控參數(shù)，可以反映微生物培養(yǎng)過程中底物的利用、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的合成及微觀代謝途徑通量的變化情況[25]，3 株菌培養(yǎng)過程中RQ在初期都在1.0左右波動，這是因為菌體在生長初期，只要有足夠的氧氣，葡萄糖就會進入檸檬酸循環(huán)，其反應(yīng)式為：C6H12O6+6O2=6CO2+6H2O，產(chǎn)生的能量主要供給細胞的生長[21,25]。隨著產(chǎn)物和副產(chǎn)物的合成，RQ會發(fā)生變化，本研究中，當PSA快速合成時（20～48 h），RQ從1.0逐漸降低至0.7，而其余兩株菌PSA產(chǎn)量偏低，乙酸含量顯著偏高（P＜0.01），RQ顯著高于高產(chǎn)菌的RQ（P＜0.01）。有報道指出，葡萄糖被分解利用后產(chǎn)生乙酸，RQ值大約為1.0[26]，N164乙酸產(chǎn)量最高可達到5.52 g/L，因此RQ顯著高于N149。3 株菌發(fā)酵過程中的這些差異說明：RQ可能很大程度與PSA和乙酸、生物量增長有密切關(guān)系，當PSA快速合成過程中，RQ值在0.7左右。因此通過在線控制RQ有可能調(diào)節(jié)PSA和乙酸、生物量。

2.4 氮源添加對PSA產(chǎn)量和生物量的影響

圖2 不同氮源的添加對大腸桿菌搖瓶發(fā)酵的生物量、PSA產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen sources on dry biomass yield and PSA titer in shake flask fermentation by E. coli

3 株菌株都在48 h后出現(xiàn)生物量下降，PSA產(chǎn)量增長緩慢的趨勢，這可能是發(fā)酵中后期出現(xiàn)營養(yǎng)元素不足（氮源、維生素、金屬離子或生長因子），導致細胞活力下降，進而出現(xiàn)PSA增長緩慢的問題。為解決該問題，考慮添加新的營養(yǎng)物質(zhì)以促進細胞生長。工業(yè)上常用的易溶于水，方便補料操作的氮源有谷氨酸鈉、酵母浸膏、玉米漿干粉等。本研究以N149菌為研究對象，采用搖瓶進行氮源篩選，按照0、24、48 h三個時間點以及0.2、0.5、1 g/100 mL質(zhì)量濃度（干質(zhì)量/發(fā)酵體積）分別添加至發(fā)酵液中，結(jié)果如圖2所示。

從圖2A可以看出，添加谷氨酸鈉后生物量和PSA增長趨勢并不明顯，說明發(fā)酵過程并不缺乏氨基態(tài)氮源。從圖2B可以看出，添加酵母浸膏的批次在0、24 h時，生物量增長比較明顯，并且在相同質(zhì)量濃度下增長幅度都比較接近，0 h添加1 g/100 mL的酵母浸膏時生物量增長幅度最大，比對照增加了36.33%，但在48 h添加時，生物量未見提高；24 h添加1%酵母浸膏時，PSA比對照增長幅度為7.49%，說明在發(fā)酵的前中期添加酵母浸膏對生物量有較好的促進效果，在發(fā)酵后期添加酵母浸膏時，生物量增長不明顯，而中后期添加酵母浸膏時PSA有小幅度增長。從圖2C可以看出，在0、24 h添加玉米漿干粉時，生物量增長比較明顯，生物量增長幅度最大的是0 h添加1 g/100 mL玉米漿干粉，生物量比對照增加了53.04%，但在48 h加入玉米漿干粉時，最大增長幅度為12.17%；在0、48 h添加玉米漿干粉PSA產(chǎn)量遠不及在24 h添加玉米漿干粉PSA產(chǎn)量高，24 h添加1%玉米漿干粉時PSA增長幅度最大，為14.47%，說明玉米漿干粉添加的方式對PSA產(chǎn)量有較大的影響。

綜合以上結(jié)果可知，谷氨酸鈉作為氮源，是一種單獨的氨基酸，添加后生物量并未見增長，說明大腸桿菌發(fā)酵過程中不缺氮源，酵母浸膏和玉米漿干粉添加后，生物量均有增加，說明兩種有機氮源中營養(yǎng)成分對于大腸桿菌的生長有很好的促進效果。但兩者對PSA產(chǎn)量的促進作用差異比較大，玉米漿干粉的促進效果好于酵母浸膏，可能是因為兩者的氨基酸組成以及其他營養(yǎng)成分的差異所造成。張樂等[27]研究玉米漿和酵母浸膏對丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用095K玉米漿干粉完全替換酵母浸膏時，丁二酸產(chǎn)量從28.45 g/L提高到29.43 g/L，進一步分析了玉米漿干粉組分差異，添加影響較大的4 種氨基酸和2 種維生素后，丁二酸產(chǎn)量進一步提高到了32.56 g/L，說明有機氮源中的氨基酸組成和維生素對目標產(chǎn)物的影響非常大。本實驗發(fā)現(xiàn)玉米漿干粉對大腸桿菌生長和PSA合成有較好的促進作用，因此選擇玉米漿干粉作為氮源進一步研究流加策略。

2.5 玉米漿干粉對大腸桿菌發(fā)酵過程RQ的影響

為了解玉米漿干粉對大腸桿菌發(fā)酵過程中代謝的影響，采用50 g/L的玉米漿干粉溶液分別在20 h和40 h加入到發(fā)酵液中，累計最終質(zhì)量濃度為10 g/L。如圖3A所示，OUR在12 h前快速增長，并在17 h達到最大值0.23 mol/（L·h），隨后開始逐步下降，CER則在7 h達到最大值，隨后保持相對穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束；RQ在10 h前保持在1.0上下波動，隨后開始下降并維持在0.7左右波動，41 h后開始上升至0.9左右。圖3B顯示了兩次添加玉米漿干粉后的OUR、CER和RQ的變化，從整體趨勢上來看，兩次添加玉米漿干粉導致CER和OUR出現(xiàn)較為明顯的增加，RQ也相應(yīng)從0.7提高至0.9。出現(xiàn)這種變化的原因可能是添加玉米漿干粉后，細胞獲得足夠多的營養(yǎng)因子后進一步生長，從而導致氧的消耗速率提高，二氧化碳的產(chǎn)生量也加大，反映在OUR曲線上看就是不再下降，而是維持平穩(wěn)趨勢。從RQ來看，添加玉米漿干粉后，RQ從0.7慢慢升高至0.9，可能是菌體的代謝發(fā)生了變化，生長和PSA生產(chǎn)同時進行。這一現(xiàn)象表明，RQ與細胞生長以及PSA生產(chǎn)有很強的相關(guān)性，因此有可能是調(diào)控PSA合成的理想實時在線參數(shù)。

圖3 發(fā)酵過程不添加玉米漿干粉（A）和添加玉米漿干粉（B）對OUR、CER和RQ的影響Fig. 3 Time courses of OUR, CER and RQ in fed-batch fermentation by E. coli in control (A) and with batch feeding of corn steep powder (B)

2.6 在線RQ調(diào)控流加玉米漿干粉策略比較

由于PSA是在細胞內(nèi)表達，然后通過細胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)出胞外[28]，細胞的數(shù)量在一定程度上影響著PSA的產(chǎn)量，因此可考慮進一步提高細胞密度。根據(jù)搖瓶實驗結(jié)果顯示，玉米漿干粉既可提高生物量也可以提高PSA產(chǎn)量，然而添加時機和添加量對PSA產(chǎn)量影響大，因此需要在生物量的增長和PSA合成之間進行平衡。PSA產(chǎn)量較高的菌種在發(fā)酵過程中，RQ維持在0.7左右。而玉米漿干粉補入對RQ影響又比較顯著，可以采用流加玉米漿干粉提高生物量的同時通過控制玉米漿干粉流加速率對RQ進行調(diào)控，從而取得高生物量的同時也能提高PSA產(chǎn)量。

圖4 不同策略下生物量（A）、乙酸（B）、PSA產(chǎn)量（C）及RQ（D）變化趨勢Fig. 4 Time courses of dry biomass yield (A), acetic acid (B), PSA titer (C)and RQ (D) in fed-batch fermentation by E. coli using different strategies

從圖4A可見，流加玉米漿干粉的兩個批次生物量增長明顯高于對照，當RQ控制在0.9時，生物量最高可達到65.7 g/L，RQ控制在0.8時，生物量最高可達到55.2 g/L，分別是對照生物量的1.45 倍和1.22 倍。圖4B顯示，RQ控制在0.9時，乙酸整體質(zhì)量濃度高于RQ控制在0.8的批次和對照?？赡苁且驗檫@株大腸桿菌乙酸的產(chǎn)生是本底表達，只要有碳源利用就會產(chǎn)生乙酸。計算乙酸對菌體的得率發(fā)現(xiàn)，對照組、RQ 0.8、RQ 0.9的批次乙酸/生物量分別為0.055、0.051、0.052，這3 組數(shù)據(jù)都比較接近，說明生物量的提高也會帶來乙酸質(zhì)量濃度的提高。因此，流加玉米漿干粉對乙酸的產(chǎn)生無顯著影響（P＞0.05）。圖4C顯示，RQ 0.8、RQ 0.9的批次在60 h分別達到12.83、10.42 g/L，比對照分別提高了45.30%、18.01%。圖4D顯示了不同策略下RQ的實際變化曲線，可以看出，流加玉米漿干粉可有效實時在線控制RQ，隨著玉米漿干粉流加量的提高，RQ也會提高。這可能是流加玉米漿干粉后，刺激了細胞的生長，使得部分細胞快速生長，而細胞在快速生長階段RQ控制在1.0，因此流加玉米漿干粉后RQ會適當提高。

表3 不同調(diào)控方式下菌體生物量及PSA產(chǎn)量和速率參數(shù)Table 3 Dry biomass yield and calculation of PSA yield and rate parameters in three fermentation modes

瞿亮等[29]采用RQ在線控制葡萄糖流速，以刺激脂肪酸的合成，DHA產(chǎn)量提高了12.19%。程奔等[30]也采用RQ在線實時控制葡萄糖流速以提高酵母的生物量。所不同的是已報道文獻控制的是葡萄糖流速，而本研究控制的是氮源流速?？刂频吹淖钪饕獌?yōu)勢在于維持細胞的生長活力，以持續(xù)穩(wěn)定地進行目標產(chǎn)物的合成。然而，其中較大的技術(shù)難點在于氮源一旦過量則會導致整個代謝途徑的變化，使得細胞的生長占據(jù)主要地位。付旭東等[31]在大腸桿菌合成PSA前期停止補充氨水并補入適量蛋白胨，最終PSA產(chǎn)量有所提高，此結(jié)果和本研究具有一致性。當玉米漿干粉補入量提高后，PSA產(chǎn)量得到很好的提高，如表3所示，與對照相比，RQ 0.8的批次玉米漿干粉用量增加了9 g/L，PSA產(chǎn)量提高了45.30%。隨著玉米漿干粉用量繼續(xù)增加PSA產(chǎn)量反而比RQ 0.8批次降低18.78%。可見，玉米漿干粉的用量對PSA影響非常大。實際上，由于RQ 0.9補入的玉米漿干粉偏多，導致細胞過度生長，生物量高達65.7 g/L，盡管PSA產(chǎn)量比對照提高了，但是葡萄糖轉(zhuǎn)化量（YP/S）大大降低，僅29.6 mg/g，比對照降低了28.50%，對于工業(yè)化生產(chǎn)來說，原料成本將大幅度提高。由此可見，玉米漿干粉的流加策略對PSA產(chǎn)量及生產(chǎn)成本會有很大的影響。而RQ在線實時監(jiān)控則可以隨時了解菌體的代謝狀況，并據(jù)此對補料進行實時調(diào)控，從而能穩(wěn)定PSA的生產(chǎn)，這對PSA工業(yè)化生產(chǎn)將具有重大的意義。

表4 大腸桿菌工藝調(diào)控方式及PSA產(chǎn)率與文獻結(jié)果的比較Table 4 Comparison of PSA productivity of E. coli using the strategy presented in this study with literature data

采用離子束誘變大腸桿菌產(chǎn)PSA的研究甚少，其中張麗敏等[19]采取離子束誘變處理得到高產(chǎn)PSA菌株的產(chǎn)量提高率為24.00%，但并沒有進一步研究發(fā)酵工藝。Chen Fang等[14]采用基因改造加強了PSA合成途徑并敲除競爭性途徑中的相關(guān)基因，PSA產(chǎn)量提高率達到85.00%。如表4所示，本研究通過離子束誘變得到的菌株P(guān)SA產(chǎn)量提高率為36.81%，采用RQ在線調(diào)控流加玉米漿干粉后，PSA產(chǎn)量提高率相對出發(fā)菌株的PSA提高率達到了88.95%。最終產(chǎn)量達到12.83 g/L，高于大部分文獻報道的PSA產(chǎn)量。盡管本研究所采用的離子束誘變技術(shù)應(yīng)用于PSA菌株篩選已有文獻報道，但篩選得到的菌株產(chǎn)量提高了36.81%，相對已有報道的產(chǎn)量提高率24.00%有所提高，此外，本研究基于誘變得到的不同菌株進行了深入研究，得到了工藝調(diào)控的思路，且采用RQ調(diào)控玉米漿補料的方式在PSA生產(chǎn)中鮮見應(yīng)用，具有一定的新穎性。采用RQ在線實時調(diào)控玉米漿干粉補料工藝的產(chǎn)量提高率為45.30%，和其他研究相比不高，但RQ是從代謝角度反映菌體在發(fā)酵過程中的實時變化情況，因此可以用于指導PSA的中試放大，并且在PSA生產(chǎn)過程中可實時監(jiān)控菌體代謝情況，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

本研究采用低能離子束注入誘變結(jié)合RQ在線實時調(diào)控PSA生產(chǎn)的策略，誘變得到1 株P(guān)SA產(chǎn)量最高為3.94 g/L的突變株，通過RQ在線實時調(diào)控流加玉米漿干粉使得PSA產(chǎn)量達到12.83 g/L，比對照提高了45.30%，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高了88.95%。低能離子束注入誘變產(chǎn)生的菌株P(guān)SA產(chǎn)量最低和最高之間的差異可達到77.48%（P＜0.01），通過比較產(chǎn)量差異極大菌株的RQ變化規(guī)律可了解高產(chǎn)菌株在RQ上的表現(xiàn)性狀，從而制定相應(yīng)的工藝調(diào)控策略。在PSA生產(chǎn)期，流加玉米漿干粉將RQ控制在0.8左右是一種易于實現(xiàn)的控制策略，既能促進細胞生長，也能提高PSA產(chǎn)量。與傳統(tǒng)誘變選育高產(chǎn)菌株的研究相比，本研究特別利用了產(chǎn)量較低的菌株作為參照，通過尾氣分析不同菌株的RQ變化規(guī)律，得到低產(chǎn)和高產(chǎn)菌株的RQ差異，進而在后續(xù)工藝調(diào)控上應(yīng)用RQ控制策略，最終實現(xiàn)了PSA產(chǎn)量的大幅度提高，因此本研究提出的離子束注入誘變結(jié)合RQ在線實時補料的思路對于其他發(fā)酵工藝產(chǎn)品具有一定的借鑒意義，此外，在PSA產(chǎn)業(yè)化放大也具有很好的參考價值。