呂小麗，朱春燕，郭平，胡重怡，張威，王棟*

1. 江西省食品檢驗檢測研究院（南昌 330001）；2. 贛州市全標生物科技有限公司（贛州 341100）

多菌靈（Carbendazim）又名棉萎靈、苯井咪唑44號，分子式為C9H9N3O2，為高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑，難溶于水和一般有機溶劑，可溶于硫酸、鹽酸和醋酸等有機酸。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，殘留期較長，對大鼠急性口服半數(shù)致死量為8.0～10 g/kg，小鼠口服半致死量為5.0 g/kg，對人有一定的毒性，可引起精神恍惚、惡心嘔吐、頭昏頭疼等中毒癥狀。因此，農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈的殘留越來越引起人們的重視。各國對多菌靈的限量要求也越來越嚴格。2011年，歐盟管理委員會發(fā)布（EC）No 559/2011號令，將柑桔中多菌靈限量由原來的0.5 mg/kg調(diào)整為0.2 mg/kg[1]。2015 年，歐委會根據(jù)（EC）No 1107/2009法規(guī)，準備逐步淘汰多菌靈[2]。國際食品法典委員會規(guī)定多菌靈在黃瓜、橙等作物中的46項限量，限量最低為0.05 mg/kg[3]。美國于07年12月撤銷了多菌靈的限值，而在2009年1月，美國FDA全面禁止進口有多菌靈殘留的農(nóng)產(chǎn)品[3]。為了更好地應(yīng)對國外技術(shù)壁壘，建立相應(yīng)的檢測方法是非常必要的。

目前測定多菌靈殘留的方法主要有分光光度法[4]、液相色譜法[5-10]、液相色譜質(zhì)譜法[11-12]、導(dǎo)數(shù)同步熒光法[13]。試驗在弱堿性條件下，采用乙酸乙酯提取試樣中的多菌靈，用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行檢測，外標法定量。檢測基體包括蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄，經(jīng)方法驗證后，方法的線性范圍、定量限、回收率和精密度均能滿足多菌靈殘留量的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀（Agilent 6495，Agilent公司）；旋渦混合器（IKA MS2，德國）；振蕩器（WSZ-100A，上海一恒科技）；離心機（TDL-5-A，上海安亭）；旋轉(zhuǎn)濃縮儀（R-215，瑞士BUCHI）；氮吹濃縮儀（NEVP-24，美國Organomation）。

1.2 樣品、試劑和材料

蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄，市售。用組織搗碎機將樣品勻漿，混合均勻后裝入潔凈容器內(nèi)密封并做好標識，即為試樣。所有試樣均在-18 ℃冰箱中保存。

乙酸乙酯、乙腈、甲醇均為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、氨水為分析純；洗脫溶劑為氨水-甲醇（體積比4:96）；配制溶液用水為超純水；多菌靈標準物質(zhì)（Dr.E公司）純度≥99.0%；混合型強陽離子交換固相萃取柱為Oasis MCX（6 mL，150 mg）。使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL 0.1 mol/L鹽酸對柱子進行活化；有機系針孔濾膜（0.22 μm，天津津騰）。

1.3 標準溶液的制備

標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取10.0 mg多菌靈標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，混勻。在-18 ℃以下避光保存；標準中間液（10 μg/mL）：在室溫下取1 mL標準儲備液置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，在4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.4 LC-MS/MS分析條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為C18柱，150 mm（柱長）× 2.1 mm（內(nèi)徑），粒度5 μm；流動相為乙腈-水（20+80，體積比）；流速為300 μL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧電離（ESI）正離子模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；分辨率為單位質(zhì)量分辨率（Unit）；毛細管電壓為3 500 V；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化器壓力為35 psi；碰撞氣為氮氣；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 主要參考質(zhì)譜參數(shù)

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 提取

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入0.5 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液和20 mL乙酸乙酯渦旋混勻后，振蕩提取30 min，以4 500 r/min離心5 min，收集上清液到150 mL濃縮瓶中。殘渣再加入20 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取1次，合并上清液，在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右，轉(zhuǎn)移至25 mL離心管中，在45℃下氮氣吹干，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，超聲5 min溶解，待凈化。

1.5.2 凈化

將上述待凈化溶液全部轉(zhuǎn)移至活化好的MCX柱中，再依次用6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、6 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液；真空抽干2 min，用6 mL氨水-甲醇溶液（4+96，V:V）進行洗脫，收集洗脫液。在45 ℃下氮吹干，準確加入5.0 mL乙腈-水溶液（20+80，V:V），超聲2 min溶解殘渣，混勻后，取部分溶解液過0.22 μm微孔濾膜后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

目前常用于提取多菌靈的溶劑有乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，因此試驗過程中分別選取乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑，取10份陰性的臍橙樣品，添加濃度為20 μg/kg，對樣品中的多菌靈進行提取，回收率如表2所示。甲醇、乙酸乙酯和堿性乙酸乙酯的提取效果都不錯，但考慮到甲醇的沸點較高，在后續(xù)濃縮過程會延長時間，可能會造成待測物損失。另由于多菌靈在酸性條件下極性較強，易溶于水及一些極性溶劑，只有在中性及弱堿性條件下極性弱，更易溶于一些非極性的有機溶劑。通過試驗也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯溶液中加入氫氧化鈉溶液后回收率更高，因此最終選擇乙酸乙酯在弱堿性條件下提取。

表2 不同提取溶劑的多菌靈回收率結(jié)果

2.2 提取方式的選擇

目前振蕩提取和勻漿提取是實驗室中水果樣品最常用的提取方法。取兩個含有多菌靈的臍橙樣品，分別采用勻漿提取和振蕩提取進行3次平行試驗，并對結(jié)果進行比較，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，振蕩提取效果更好，而且操作簡便，適合于大批量檢測，因此最終提取方式選用振蕩提取。

表3 不同提取方式下多菌靈檢出量 mg/kg

2.3 提取次數(shù)的選擇

為保證樣品中多菌靈能夠提取完全，對提取次數(shù)進行研究。試驗采用20.0 μg/kg的添加水平，改變提取次數(shù)，多菌靈的回收率如圖1所示。結(jié)果表明，振蕩提取2次，多菌靈已基本提取完全。增加提取次數(shù)會導(dǎo)致后續(xù)操作時間延長，不利于后續(xù)的濃縮步驟，因此從試驗效果、提取時間和試驗成本等因素考慮，確定提取次數(shù)為提取2次。

圖1 多菌靈回收率與提取次數(shù)變化趨勢圖

2.4 凈化方式的選擇

目前常用于多菌靈凈化的固相萃取柱有C18固相萃取柱和MCX混合型陽離子交換柱。試驗采用100.0 μg/kg的添加水平，對蘋果和臍橙樣品分別考察C18柱和MCX柱的凈化效果，多菌靈回收率結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，MCX柱凈化后多菌靈的回收率結(jié)果比C18柱凈化后回收率更高，因此選用MCX混合型陽離子交換柱作為凈化小柱。

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表4 C18固相萃取柱和MCX固相萃取柱凈化后回收率比較 %

2.5 液相色譜條件選擇

對多菌靈標準溶液進行分析時發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為流動相時，多菌靈峰型寬且拖尾，改用乙腈-水為流動相后，峰寬變小，峰形變尖銳。因此試驗采用乙腈-水為流動相。不同流動相下多菌靈標準圖譜如圖2和圖3所示。

圖2 不同流動相下多菌靈標準圖譜（流動相：甲醇-水）

圖3 不同流動相下多菌靈標準圖譜（流動相：乙腈-水）

2.6 質(zhì)譜條件的選擇

以多菌靈標準溶液為對象，用全掃描方式進行掃描，選取m/z 192.2為母離子，通過二級質(zhì)譜碎裂，獲取了三個信號最強的子離子，分別為m/z 160.1，132.0和105.0。

2.7 質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)

分別采用試劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線對同時處理的多個添加回收試驗進行回收率校準，各回收率如表5所示。從兩種標準曲線校準所得回收率可以看出兩者無很大區(qū)別，說明基質(zhì)影響小，而且由于多菌靈為限用藥物，很難獲得完全陰性的樣品作為基質(zhì)，因此方法采用試劑線性進行校準。

表5 試劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線校準后回收率數(shù)據(jù)（n=6）

2.8 方法學(xué)驗證

2.8.1 線性范圍和定量限

在方法所確定的試驗條件下，多菌靈在5.0～200 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性回歸曲線如圖4所示。當添加水平為0.01 mg/kg時，信噪比（S/N）大于10，可滿足定量檢測要求；方法的定量限可達0.01 mg/kg，能夠滿足我國對水果中多菌靈監(jiān)控的需求。

圖4 線性回歸曲線

方法采用向陰性樣品中添加的方式進行方法學(xué)評估。以不含多菌靈的蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄為基質(zhì)，進行10.0，20.0和40.0 μg/kg三個不同濃度水平的添加回收試驗，每個水平進行6次平行測定，回收率范圍在88.2%～100.5%之間，相對標準偏差在2.05%～8.78%之間，具體結(jié)果如表6所示，表明方法能夠滿足農(nóng)獸藥殘留檢測的需求。

表6 不同基質(zhì)加標樣品的回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，樣品在弱堿性條件下采用乙酸乙酯振蕩提取后，用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄等水果中多菌靈，經(jīng)方法驗證后，方法的線性范圍、定量限、回收率和精密度均能滿足多菌靈殘留量的檢測要求。方法靈敏度高、回收率高，可用于水果中多菌靈的確證檢測。