梅娜娜，周廣運，王東亮*

1. 國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心（東阿 252201）；2. 東阿阿膠股份有限公司（東阿 252201）

膠原是在機體種類眾多的蛋白質(zhì)中一類重要的蛋白質(zhì)，也是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)。人體成分有16%左右為蛋白質(zhì)，其中30%～40%屬于膠原蛋白[1]。膠原通常以三螺旋的結(jié)構(gòu)狀態(tài)存在于機體組織（皮、骨骼、軟骨和肌腱等）中。其氨基酸組成主要是甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸。其中羥脯氨酸是膠原的特征氨基酸。膠原作為一類天然大分子，因加熱或者酶解等外界條件會導(dǎo)致其不同程度的水解，產(chǎn)生不同類型的膠原水解產(chǎn)物，主要包括明膠及膠原蛋白。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，膠原及其水解產(chǎn)物在生物醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)及皮革等領(lǐng)域方面的應(yīng)用也越來越廣泛[2]。

1 膠原在各組織中的分布

膠原在不同的器官組織有不同的分布，并且長度也隨著種類的不同而不同。如表1所示。在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原中，每一多肽鏈長300 nm，由1 000個氨基酸組成。在Ⅵ和Ⅹ型膠原蛋白中其三螺旋區(qū)域分別由200個和460個氨基酸組成。在皮膚膠原中，膠原分子通過細(xì)胞外賴氨酰氧化酶形成的溶血素殘基之間的鏈間交聯(lián)而并排堆疊在一起[3]。膠原蛋白賦予結(jié)締組織的強度、剛性和柔韌性，并對于動物的成長與健康必不可少。

另外，膠原的品質(zhì)與不同動物來源的原料也有密切的關(guān)系。不同動物主要包括陸源性畜禽（豬、牛、驢等）的皮骨、淡水魚魚皮魚鱗及深海魚皮骨。從不同動物來源的膠原所含有的特征性羥脯氨酸含量看，陸源性畜禽＞淡水魚皮魚鱗＞深海魚皮。從市場角度看來自畜禽皮骨（一般是畜禽加工副產(chǎn)物）、淡水魚魚皮魚鱗的膠原相關(guān)產(chǎn)品性價比明顯高于深海魚皮來源的產(chǎn)品[4]。

表1 膠原類型及其在動物組織中的分布[5-6]

接表1

2 動物膠原的結(jié)構(gòu)

雖然不同種類動物的膠原的結(jié)構(gòu)和組成不同，但經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)膠原結(jié)構(gòu)有著共性規(guī)律。

2.1 一級結(jié)構(gòu)——氨基酸組成

膠原占動物總蛋白的1/3，是一類含量豐富蛋白質(zhì)[7]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特，三肽結(jié)構(gòu)中重復(fù)性地含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸（甘氨酸-脯氨酸-Y和甘氨酸-X-羥脯氨酸，其中X、Y可以是任何氨基酸）。1 mol膠原分子中包含了1/3甘氨酸，0.7/3脯氨酸和羥脯氨酸，和1.3/3其他氨基酸，見表2。甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸占總組成膠原氨基酸的57%[6]。

不同氨基酸在膠原的結(jié)構(gòu)中可起到不同的作用。不同氨基酸4-羥脯氨酸的含量影響分子內(nèi)氫鍵的形成，對分子三螺旋結(jié)構(gòu)型的穩(wěn)定十分重要。另外，特殊的羥賴氨酸部分會繼續(xù)進行糖基化修飾[5]。

2.2 二級結(jié)構(gòu)

其中每個α鏈中氨基酸排列組成可能相同，也可能不同。每條α鏈可以命名為αn(N)p，n表示α鏈不同種類，N表示膠原類型，p表示多肽數(shù)量。如，α1(Ⅰ)2α2(Ⅰ)表示Ⅰ型膠原中含有兩條α1鏈和一條α2鏈。C末端前肽參與啟動三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，N末端前肽則與形成膠原纖維對的直徑大小有關(guān)[6]。

表2 I～VII型膠原蛋白中氨基酸和糖的組成（殘基/1 000個氨基酸殘基）[6]

圖1 膠原蛋白的初級、二級、三級結(jié)構(gòu)及三重螺旋結(jié)構(gòu)示意圖[8]

2.3 三四級結(jié)構(gòu)

膠原分子中三條α多肽鏈以右手螺旋的方式擰成三螺旋結(jié)構(gòu)。具體來說，膠原由平行線型鏈組成，而每一線型是由三條左旋的α多肽鏈通過鏈與鏈間的相互作用緊密結(jié)合而形成的右旋的三重螺旋結(jié)構(gòu)。在膠原分子中除了含有三螺旋結(jié)構(gòu)域，還含有非螺旋結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要是肽鏈之間的次級鍵的作用，即氨基酸殘基側(cè)鏈的極性基團產(chǎn)生的離子鍵、氫鍵和范德華力以及非極性基團產(chǎn)生的疏水鍵、范德華力等作用，除了蛋白質(zhì)分子這些次級鍵外，膠原分子內(nèi)和分子間還有3種交聯(lián)：醇醛縮合交聯(lián)、醛胺縮合交聯(lián)、醛醇組氨酸交聯(lián)。

膠原分子之間可自發(fā)通過共價鍵搭建交聯(lián)，形成高度有序的分子更大高級結(jié)構(gòu)（四級結(jié)構(gòu)）的蛋白質(zhì)，聚集成束成膠原纖維。膠原分子通過分子內(nèi)或分子間的作用力形成不溶性纖維，故膠原是不溶性硬蛋白。

3 膠原水解產(chǎn)物-明膠和膠原蛋白

膠原是動物組織器官中存在的一類天然蛋白質(zhì)，且有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，保留有生物活性。主要分布在結(jié)締組織、皮膚、肌肉、骨骼、牙齒、內(nèi)臟、韌帶、鞏膜與眼睛等組織器官中。不溶于冷水和熱水。

明膠是膠原在酸、堿、酶或者高溫作用下的變性產(chǎn)物。分子量分布較寬，工業(yè)上生產(chǎn)的明膠分子量為15 000～25 000 Da。明膠不溶于冷水，在冷水中只會吸水并溶脹，加熱至60 ℃以上，可溶于水。明膠的水溶液冷卻后，成為凝膠，凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

膠原蛋白中三螺旋結(jié)構(gòu)徹底松開，且降解成多分散的肽段，還可能包括低聚肽，分子量從幾千萬到幾萬道爾頓，分子量分布很寬，能溶于冷水，且能被蛋白酶利用。并且根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31645—2018規(guī)定富含膠原蛋白的新鮮動物組織在水解到一定程度后，分子量在10 000 Da以下時，被稱為膠原蛋白肽。

圖2 膠原-膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)變化過程[4]

4 不同分子量膠原的功能及應(yīng)用

4.1 三螺旋結(jié)構(gòu)完成的膠原的功能與應(yīng)用

膠原在動物細(xì)胞中扮演著黏結(jié)功能的角色，廣泛存在與動物細(xì)胞外，是細(xì)胞外基質(zhì)最重要的組成成分，也是動物結(jié)締組織中最主要的一種結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。參與組織的形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞，與細(xì)胞的增殖、分化、免疫，動物運動、關(guān)節(jié)潤滑，腫瘤轉(zhuǎn)移、傷口愈合、血液凝固等關(guān)系密切，也與結(jié)締組織膠原疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。膠原具有含量豐富、生物相容性強、高孔隙率、易加工、親水性、低抗原性及體內(nèi)吸收性等特性[9-11]。

醫(yī)用。膠原在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在廣泛應(yīng)用，包括縫合線、止血劑、組織替代和再生（骨、軟骨、皮膚、血管、氣管、食道等）、整容手術(shù)（嘴唇、皮膚）、牙科復(fù)合材料、皮膚再生模板、膜氧合器、避孕藥（屏障法）、可生物降解的基質(zhì)、神經(jīng)保護性包裹物、植入物、角膜繃帶、隱形眼鏡、給藥等[12-13]。其是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用最廣泛的生物材料之一[14]。膠原可通過其官能團的反應(yīng)改性，引入交聯(lián)或生物分子，產(chǎn)生具有機械或生物特性的材料[11,15]。但使用膠原的主要缺點是制作成本費用高（時間高消耗和提取純化步驟的復(fù)雜性）及為避免變性和體外溶脹需采用獨特的加工條件[16-17]。膠原與人體衰老和疾病有密切的關(guān)系，這主要與膠原側(cè)鏈胺基團（Lys，Arg）和還原糖糖化之間的非酶化學(xué)反應(yīng)對基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化有關(guān)[18]。法醫(yī)利用骨骼中膠原蛋白含量與非膠原蛋白含量的比值降低的幅度來判斷未知骨骼遺骸的死后間隔[19]。

選SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)做出分析，（± s）表示神經(jīng)功能缺損情況，實施t檢驗，（%）表示不良反應(yīng)、療效，實施χ2檢驗，當(dāng)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

食用。因膠原中含有人體必需和非必需氨基酸共18種。同時甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量較高。故膠原蛋白是一種高營養(yǎng)價值的食品。膠原作為人體皮膚真皮的重要組成成分，可與彈性蛋白一同形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使皮膚保持一定的硬度與彈性。膠原蛋白中所含有的大量的甘氨酸具有鎮(zhèn)靜的作用，可以用于神經(jīng)衰弱和焦慮癥的治療。有文獻表明膠原可以緩解胃潰瘍患者的疼痛感。則膠原在保健食品行業(yè)有較好的應(yīng)用。另膠原在食品添加劑、食品品質(zhì)改良和食品包裝材料等方面也有廣泛的應(yīng)用。張義[20]通過添加煙熏液、核黃素和單寧，發(fā)現(xiàn)三者均可較好地改善膠原蛋白膜的機械性能和阻隔性能，可用于不同目的下可食蛋白膜的強化，使膠原在包裝、保鮮及功能性應(yīng)用方面具有較廣的應(yīng)用價值。曾多[21]以濕度為熟化過程的控制條件，初步篩選出有效濕度范圍，為60%≤RH＜80%。并進一步對濕度、溫度和時間的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，濕度優(yōu)化分三個階段，溫度優(yōu)化簡化工藝流程，第一第二階段合并，降低前兩個階段的熟化時間，為48 h。結(jié)果確定第一、第二、第三階段的最佳濕度分別為60%，70%和75%。第一、第二和第三階段的最佳熟化溫度分別為65，65和75 ℃。最佳熟化時間：第一第二階段合并的時間為48 h，第三階段時間為2～6 h。最后采用DSC和ATR FTIR探索腸衣的保水機制，結(jié)果表明不同熟化條件下水分子與膠原的結(jié)合能力不同，加濕熟化可促進或改變水分子與膠原的結(jié)合，從而增強膠原的保水能力。

飼用。為將制革得到的殘次皮料、皮邊角料等副產(chǎn)物充分利用起來，有研究者采用物理、化學(xué)或者生物技術(shù)的方法處理得到飼料用的膠原蛋白粉。魏紅芳等[22]按照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》分別測定膠原蛋白粉和豆粕中水分、粗蛋白、粗灰分及粗脂肪含量，用H 835-50氨基酸分析儀測定兩者17種氨基酸的含量。結(jié)果表明膠原蛋白粉中粗蛋白和鈣的含量高于豆粕，粗脂肪和磷的含量低于豆粕。膠原蛋白粉總氨基酸含量為69.35%，高于豆粕中總氨基酸含量（41.91%）。谷氨酸、精氨酸等均高于豆粕，其中甘氨酸的含量為豆粕的11.27倍，脯氨酸是豆粕的4.54倍。說明膠原蛋白粉可以部分代替豆粕在畜禽飼料中的推廣。

4.2 明膠的功能及應(yīng)用

明膠是膠原經(jīng)熱變性或者物理、化學(xué)方法降解而得，部分保留了膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，具有良好的成膜性、凝膠性、生物可降解性、生物相容性等優(yōu)點。在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛。

翁武銀等[23]以羅非魚皮為原料來提取明膠制備可食用膜，并考察脫水處理對其理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明所制備的可食膜其拉伸強度（TS）達37.5 MPa。溫度達到100或120 ℃后，明膠的TS逐漸降低，疏水作用和共價鍵作用在明膠膜中的貢獻增強，從而膜的玻璃轉(zhuǎn)化溫度得到提高。可以證明脫水和熱處理可改善魚皮明膠膜的機械性能、耐水性能和穩(wěn)定性能。藍廣芊[24]采用正交試驗和單因素試驗，確定添加氯化鈣、甘油、單寧酸的添加量，制得殼聚糖/明膠復(fù)合止血材料。確定最佳制備條件為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%。止血效果是醫(yī)用明膠海綿和純殼聚糖海綿的3～4倍。另外，明膠可用作膠囊劑囊材，作為基質(zhì)，可應(yīng)用于凝膠劑；作為載體可應(yīng)用于基因、疫苗等藥物的遞藥系統(tǒng)等。在應(yīng)用過程中又因明膠中有亞氨基、醛基等活性基團的存在，其在儲存過程中易發(fā)生交聯(lián)，故研究者通常將明膠進行改性，增強其凝膠強度、機械性能等特性。米田裕治等[25]以無水琥珀酸進行明膠改性，制備琥珀酰明膠，用此改性明膠代替明膠制備軟膠囊，膠囊內(nèi)容物為琥珀酰明膠不溶物和含有親水基的化合物（如苯酚衍生物），制備了一種有易溶性，且不易造成崩解延遲的軟膠囊劑。

4.3 小分子膠原蛋白的功能及應(yīng)用

膠原蛋白多肽是經(jīng)膠原或者明膠經(jīng)水解處理后制得的一系列具有功能性且分子量在2 000～30 000 Da的小分子多肽。此類小分子膠原蛋白多肽比膠原和明膠具有不同的特性。如不具有明膠的凝膠性能，具有易吸收性，更強的抗氧化性、抑菌性、抗血壓等特性。

易透皮性。陶宇[26]通過研究沙海蜇膠原蛋白肽體外透皮吸收研究發(fā)現(xiàn)，分子量越小的膠原蛋白多肽表現(xiàn)出越好的透皮吸收性能。且通過累計透皮吸收量和時間的曲線得到沙海蜇膠原蛋白肽體外透皮吸收的零級動力學(xué)方程，Mr＜2 500，Q=209.29t-6.801；2 500＜Mr＜8 000，Q=84.381t+133.75；Mr＞8 000，Q=52.597t+72.96。樣品濃度越高并在pH 8左右時，膠原蛋白肽表現(xiàn)出較好的體外透皮吸收性能。

抗氧化性。膠原或明膠水解后所得的多肽結(jié)構(gòu)抗氧化性增強，不同來源的膠原均可制備具有抗氧化性的膠原蛋白多肽。見表3。王靜等[27]通過測定蛋白酶酶解液中不同分子量的海參多肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)四種不同分子量肽SPH I（＞10 kDa）、S PH Ⅱ（5～10 kDa）、SPH Ⅲ（3～5 kDa）、SPH Ⅳ（＜3 kDa）的活性氧的清除能力大小依次增強。證明多肽分子量越小抗氧化能力越強。王杉杉[28]通過超濾、凝膠過濾層析等方法分離出牦牛皮膠原蛋白抗氧化活性肽I-D7。并測定此肽的氨基酸序列為Phe-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Gln-Glu，活性肽的分子量為954.5。

抗菌性。Gomez-guillen等[29]分別用魷魚膠原和金槍魚皮膠原降解制備分子量小于1 kDa和1～10 kDa的多肽，通過瓊脂擴散法研究多肽對常見細(xì)菌的抗菌能力，結(jié)果表明上述兩種多肽對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌及乳酸菌等都有明顯的抗菌性能。

降高血壓。高血壓病在人體疾病中的發(fā)病概率逐年增加，主要是高血壓會損傷血管，身體重要器官發(fā)生缺血和功能受損，其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）通過將無活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成使血管收縮的血管緊張素Ⅱ，就此引發(fā)高血壓疾病。有些研究者已經(jīng)通過將動物膠原水解成功能性小分子多肽，利用小分子膠原蛋白多肽抑制ACE的活性，從而降低高血壓的發(fā)病概率。Ichimura等[30]通過連續(xù)對自發(fā)性高血壓大鼠口服喂養(yǎng)豬皮膠原水解產(chǎn)物多肽，發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽Gly-Phe-Hyp-Gly-Pro的IC50為91 Μm，且Gly-Pro作為大量重復(fù)序列存在于膠原中?？诜秤?00 mg/kg的Gly-Pro顯著降低大鼠的血壓。

表3 由膠原及其水解產(chǎn)物明膠制備的具有抗氧化活性的多肽結(jié)構(gòu)[31]

5 結(jié)語

隨著人們生活水平的提高，生活需求不斷提升。膠原及其水解產(chǎn)物以其獨特優(yōu)勢在食品、化妝品、醫(yī)療等行業(yè)的利用將越來越廣泛。但是目前市場產(chǎn)品魚龍混雜，各種標(biāo)志含有膠原蛋白或者膠原蛋白多肽保健產(chǎn)品的廠家對膠原及其水解產(chǎn)物的概念分不清楚，誤導(dǎo)消費者。來自不同種類動物的膠原亦有不一樣的功效，為避免市場對來自不同動物的膠原產(chǎn)品進行混淆視聽，未來對不同物種膠原的鑒定研究應(yīng)更加深入。