周明，秦修遠(yuǎn)，賈福懷，袁媛，谷瑞增，劉文穎*

1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）；2. 寧波御坊堂生物科技有限公司（寧波 315012）

高血壓是引發(fā)中風(fēng)、冠心病和心肌梗塞等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因子，預(yù)防和治療高血壓病是當(dāng)今社會(huì)十分重要的研究課題[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）是高血壓發(fā)病機(jī)制中起重要作用的酶，能夠催化血管緊張素Ⅰ（Angiotensin，AngⅠ）轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（Angiotensin，AngⅡ），起到升壓的作用，同時(shí)降解舒緩激肽（Bradykinin，BK），使之失去降壓的作用。目前，很多廣泛應(yīng)用于降血壓的藥物，其原理就是抑制ACE的活性。但是長期服用降血壓藥物易引起咳嗽、血管神經(jīng)性水腫、白細(xì)胞減少、皮疹等不良反應(yīng)[2]。來源于天然動(dòng)植物蛋白的ACE抑制肽由于降血壓效果明顯且具有良好的食用安全性，而引起學(xué)術(shù)界的重視[3]。

玉米低聚肽是以玉米黃粉為原料，經(jīng)過酶解、分離、精制等過程而得到的相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 U的肽類混合物。玉米低聚肽具有多種生物功能，如降血壓、促進(jìn)酒精代謝、抗氧化等[4-6]。目前，國內(nèi)外對(duì)玉米低聚肽的ACE抑制活性缺乏深入和系統(tǒng)的研究，并且發(fā)揮作用的具體活性肽段的結(jié)構(gòu)并不明確。試驗(yàn)以玉米黃粉為原料，通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶兩步酶解法制備出玉米低聚肽，在對(duì)其基礎(chǔ)理化成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，以反相高效液相色譜（RP-HPLC）、四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）為檢測手段，對(duì)玉米低聚肽中的ACE抑制肽段進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期明確玉米低聚肽中ACE抑制肽的活性及其結(jié)構(gòu)，為玉米低聚肽在降血壓保健食品的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

玉米黃粉（北京中食海氏生物技術(shù)有限公司）；堿性蛋白酶、中性蛋白酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；ACE（50 mU）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）：美國Sigma公司，色譜純；乙腈（美國Fisher公司，色譜純）；三氟乙酸（英國Alfa Aesar公司，分析純）。

1.1.2 設(shè)備與儀器

GSY-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；YG30噴霧干燥機(jī)（無錫市陽光干燥設(shè)備廠）；QSY-2型凱氏定氮儀（北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心）；LC-20 AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Spectra MR酶標(biāo)儀（美國DYNEX公司）；Q-TOF 2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀（英國Micromass公司）。

1.2 方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備

將玉米黃粉溶解于蒸餾水中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%→用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)15 min→調(diào)節(jié)pH至8.5，溫度為55 ℃，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解3 h→調(diào)節(jié)pH至7.0，溫度為50 ℃，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h→升溫至90 ℃，滅酶15 min→6 000×g離心10 min，取上清液→用截留分子量為2×106U的陶瓷膜過濾，取中間清液→用截留分子量為1 000 U的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 U的濾過液→噴霧干燥，得到玉米低聚肽干粉。

1.2.2 玉米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分測定

采用GB 5009.5—2016規(guī)定的方法測定蛋白質(zhì)含量，以干基計(jì)，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25；采用三氯乙酸法測定酸溶蛋白質(zhì)含量；采用GB 5009.6—2016規(guī)定的方法測定脂肪含量；采用GB 5009.4—2016規(guī)定的方法測定灰分含量；采用GB 5009.3—2016規(guī)定的方法測定水分含量[7-11]。

1.2.3 ACE抑制率測定

ACE抑制率通過RP-HPLC進(jìn)行測定[9-10]。利用0.05 mol/L的硼酸緩沖液（含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）配制50 mU/mL的ACE溶液和7.6 mmol/L的HHL溶液。將20 μL樣品溶液（空白對(duì)照為硼酸緩沖液）與30 μL ACE溶液充分混合，置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min。加入50 μL HHL溶液在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。加入100 μL 1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，最終硼酸緩沖液體積為400 μL，混勻后上機(jī)進(jìn)行RP-HPLC檢測。

色譜條件：流動(dòng)相A，V（水）:V（甲醇）:V（三氟乙酸）:V（乙酸）=70:30:0.1%:0.05%；流動(dòng)相B，V（水）:V（甲醇）:V（三氟乙酸）:V（乙酸）=20:80:0.1%:0.05%；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣體積，100 μL；檢測波長，UV 227 nm；柱溫，30 ℃。梯度洗脫條件：0～2.50 min，0～0流動(dòng)相B；2.51～4.50 min，100%～100%流動(dòng)相B；4.51～15 min，0～0流動(dòng)相B。

色譜圖中，ACE的酶解產(chǎn)物馬尿酸的峰面積與馬尿酸的濃度之間成線性關(guān)系，因此通過測定加入樣品前后馬尿酸峰面積的差別即可計(jì)算樣品的ACE抑制率。按式（1）計(jì)算。

式中：M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；N為添加樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s。

1.2.4 玉米低聚肽的分離純化

采用RP-HPLC對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行分離純化。色譜條件：樣品質(zhì)量濃度，10 mg/mL；流動(dòng)相A，V（水）:V（三氟乙酸）=100:0.1；流動(dòng)相B，V（乙腈）:V（水）:V（三氟乙酸）=80:20:0.1；檢測波長，UV 220 nm；流速，0.6 mL/min；柱溫，40℃；進(jìn)樣體積，40 μL。梯度洗脫程序：0～10 min，0～5%流動(dòng)相B；10～25 min，5%～9%流動(dòng)相B；25～35 min，9%～15%流動(dòng)相B；35～55 min，15%～15%流動(dòng)相B；55～100 min，15%～40%流動(dòng)相B；100～120 min，40%～80%流動(dòng)相B。選擇12個(gè)主要的組分峰進(jìn)行收集，通過氮吹儀除去三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑，然后真空冷凍干燥，得到12個(gè)組分峰的干粉，備用[12]。

1.2.5 抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

采用Q-TOF 2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測定玉米低聚肽的肽段結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜條件：碰撞氣體，Ar；霧化氣體，N2；離子化方式，納升電噴霧正離子；錐孔電壓，50 V；源溫，80 ℃；TOF加速電壓，9.1 kV；毛細(xì)管電壓，800 V；MCP檢測器電壓，2 150 V；MS和MS/MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度，0.1 U。首先對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測離子，然后進(jìn)行ESI-MS/MS分析，推導(dǎo)出肽段序列。

1.2.6 肽段合成方法

采用多肽固相合成法（Fmoc方法），利用多肽合成儀合成粗肽。然后利用分析型HPLC對(duì)粗肽進(jìn)行檢測，純度為60%左右。用水將粗肽溶解，利用制備型HPLC進(jìn)行純化，凍干得到純品，再用分析型HPLC進(jìn)行檢測，純度在98%以上，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，保證分子量正確。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel計(jì)算不同指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，所有圖中誤差值采用SD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

結(jié)果顯示，玉米低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為92.15%±5.26%（干基），酸溶蛋白質(zhì)含量為87.57%±5.98%，占總蛋白質(zhì)95.03%。脂肪含量為0.06%±0.01%、灰分含量為3.12%±0.38%、水分含量為3.54%±0.29%。玉米低聚肽中蛋白質(zhì)含量很高，占到了90%以上，其中酸溶蛋白質(zhì)所占比例在95%以上，說明玉米低聚肽的主要成分是較低分子量的肽類物質(zhì)以及少量的游離氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。

2.2 玉米低聚肽的ACE抑制作用

玉米低聚肽的ACE抑制活性如圖1所示。經(jīng)計(jì)算，玉米低聚肽的ACE抑制率IC50值為0.55±0.03 mg/mL。Tsai等[13]對(duì)文蛤肉蛋白水解物進(jìn)行了研究，其ACE抑制率IC50值為1.09 mg/mL；Bougatef等[14]研究了沙丁魚副產(chǎn)物蛋白水解物的ACE抑制活性，其IC50值為1.2 mg/mL，均與此次試驗(yàn)中的玉米性低聚肽的抑制能力接近。

研究表明，肽的ACE抑制活性與其分子量大小有關(guān)。ACE抑制肽的分子量比較小，一般低于1 000 U[15]。張宇昊等[16]將制備的花生肽經(jīng)超濾分離后，獲得三種不同分子量范圍的組分：＜5 000 U，1 000～5 000 U和＞1 000 U，其中分子量小于1 000 U的組分ACE抑制活性最強(qiáng)。玉米低聚肽分子量大多在1 000 U以下，這可能是玉米低聚肽的ACE抑制活性較高的原因之一。分子量的大小對(duì)維持肽的ACE抑制活性也有重要作用，小分子量的ACE抑制肽不易被腸道中的消化酶降解，能在體內(nèi)保持較高的抑制活性。

圖1 玉米低聚肽的ACE抑制作用

2.3 玉米低聚肽的分離純化

目前，分離純化蛋白肽類物質(zhì)的方法主要有高效液相色譜、體積排阻色譜、離子交換層析、大孔吸附樹脂色譜、凝膠過濾色譜等。高效液相色譜是廣泛用于分離、分析多肽的一種方法，尤其是反相高效液相色譜（RP-HPLC），已成為研究肽類的主要分離純化手段[17]。玉米低聚肽是由多種肽段組成的小分子肽的混合物，通過對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行分離純化，有助于找到其中發(fā)揮活性的主要組分。玉米低聚肽的分離色譜圖如圖2所示，依據(jù)峰形、峰高、峰面積和分離度四個(gè)指標(biāo)，選擇了12個(gè)主要的組分峰進(jìn)行收集，分別命名為1#～12#。通過氮吹儀除去三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑，再真空冷凍干燥，得到各組分峰的干粉。

圖2 玉米低聚肽的RP-HPLC分離色譜圖

2.4 玉米低聚肽分離組分的ACE抑制作用

當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，玉米低聚肽12個(gè)組分的ACE抑制活性測定結(jié)果見圖3。玉米低聚肽的12個(gè)組分均具有一定ACE抑制活性，7個(gè)組分的ACE抑制活性均比玉米低聚肽高（63.67%±3.79%），其中組分3#的活性最高（91.99%±6.32%），其次是組分1#（87.56%±3.25%）和組分4#（87.05%±7.16%），組分12#的活性最低（10.36%±1.98%）。

以上試驗(yàn)表明，玉米低聚肽的液相分離組分均表現(xiàn)出一定的ACE抑制能力，并且在相同濃度條件下，大部分分離組分的ACE抑制活性比總肽要強(qiáng)。這可能是由于液相色譜C18柱分離將相同或相近疏水性的肽段富集在一起，這些肽段具有較多相同的氨基酸側(cè)鏈，而肽段的ACE抑制活性與氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(tuán)有關(guān)，最終使得總體ACE抑制活性增強(qiáng)。

圖3 玉米低聚肽中RP-HPLC組分的ACE抑制活性

2.5 玉米低聚肽中ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定

利用Q-TOF質(zhì)譜儀，對(duì)ACE抑制活性最強(qiáng)的組分3#進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。Q-TOF是蛋白測序的一種新方法，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行測序，樣品用量少，并且能夠測定肽段的序列。Q-TOF質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源（ESI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF），通過對(duì)各個(gè)組分二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子的質(zhì)譜圖解譜，得到肽段的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。從玉米低聚肽的組分3#中共鑒定出4個(gè)肽段：AY、SAP、NAP、VNAP，結(jié)構(gòu)如表1所示。這些肽段都在二肽到四肽之間，肽段序列的分子量均在1 000 U以下。

表1 Q-TOF質(zhì)譜儀鑒定出的3#玉米低聚肽的肽段結(jié)構(gòu)

將這些肽段合成標(biāo)準(zhǔn)品，測定其ACE抑制活性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，4個(gè)肽段的ACE抑制活性如圖4所示。進(jìn)一步對(duì)4個(gè)肽段進(jìn)行了IC50值分析。經(jīng)計(jì)算，AY、SAP、NAP、VNAP抑制ACE的IC50值分別為0.036±0.005，0.039±0.004，0.112±0.010和0.205±0.018 mg/mL，玉米低聚肽的IC50值為0.55±0.03 mg/mL，由此可見，AY、SAP、NAP、VNAP的ACE抑制活性大約是玉米低聚肽的15.3，14.1，4.9和2.7倍，是具有較高ACE抑制活性的肽段。

肽段的ACE抑制活性與其氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。研究表明，當(dāng)C末端為芳香族氨基酸（包括Trp、Tyr、Phe）和Pro時(shí)，抑制肽的抑制活性增強(qiáng)；N末端為疏水性的Val、Leu、Ile或堿性氨基酸（Arg、Lys、His）的肽與ACE的親和力較強(qiáng)，抑制活性最高，但是Pro則除外[18]。此次研究鑒定出的4個(gè)ACE抑制肽AY、SAP、NAP、VNAP，C末端為Tyr或Pro，同時(shí)VNAP的N末端為Val，符合強(qiáng)ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)規(guī)律，這可能是這些肽段具有較強(qiáng)ACE抑制活性的一個(gè)原因。此外，SAP、NAP、VNAP三個(gè)肽段都有Ala-Pro氨基酸序列，NAP、VNAP都有Asn-Ala-Pro氨基酸序列，這些ACE抑制肽具體的構(gòu)效關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

圖4 玉米低聚肽中四個(gè)肽段的ACE抑制活性

ACE抑制肽要在體內(nèi)發(fā)揮作用，必須以完整形式被胃腸道吸收。有研究報(bào)道很多ACE抑制肽能夠抵抗胃腸道消化酶的水解，并且小肽很容易以完整形式在腸道中通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體吸收，另外，C末端的Pro可以提高ACE抑制肽在腸道中的穩(wěn)定性，抵抗Pro特異性肽酶的水解[19]。因此，可以推測口服強(qiáng)ACE抑制活性的AY、SAP、NAP和VNAP，尤其是SAP、NAP和VNAP能夠以完整形式吸收進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)揮降血壓作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以玉米黃粉為原料，通過兩步酶解法制備出玉米低聚肽，其總蛋白質(zhì)含量為92.15%±5.26%，酸溶蛋白質(zhì)含量為87.57%±5.98%，脂肪含量為0.06%±0.01%，灰分含量為3.12%±0.38%，水分含量為3.54%±0.29%。玉米低聚肽的ACE抑制率IC50值為0.55±0.03 mg/mL。利用RP-HPLC對(duì)其進(jìn)行分離純化，收集ACE抑制活性最高的組分峰，利用Q-TOF質(zhì)譜儀測定肽序列，鑒定出4個(gè)ACE抑制肽段：AY、SAP、NAP、VNAP，其IC50值分別為0.036±0.005，0.039±0.004，0.112±0.010和0.205±0.018 mg/mL，大約是玉米低聚肽的15.3，14.1，4.9和2.7倍，是具有較高ACE抑制活性的肽段。此次研究明確了玉米低聚肽的ACE抑制活性，并對(duì)其中的ACE抑制肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，為玉米低聚肽作為降血壓保健食品的開發(fā)利用提供了理論支持。