邢占芬，成洪達(dá)*，張平平，王清路

1. 齊魯醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院（淄博 255213）；2. 齊魯醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（淄博 255213）

熊果酸為三萜類物質(zhì)，是一種用途廣泛的食品添加劑，同時(shí)熊果酸具有很強(qiáng)的生物活性，在臨床上可用于癌癥、高血脂、潰瘍、糖尿病等疾病的治療[11-13]。熊果酸來源很廣，可以從多種植物中提取，如黃毛耳草、女貞子、冬凌草、車前草、枇杷葉等。

分子印跡技術(shù)具有鎖鑰結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)預(yù)定分子有很高的選擇性和卓越的識(shí)別性能，具有分離效率高、穩(wěn)定性好、消耗溶劑少等特點(diǎn)[1-3]?；谄鋬?yōu)良的性能，分子印跡技術(shù)已廣泛用于天然藥物有效成分分離、傳感器分子識(shí)別、色譜層析固定相和藥物傳遞等領(lǐng)域[4-7]。固相萃取技術(shù)是一項(xiàng)高效的分離富集技術(shù)，將分子印跡聚合物用作固相萃取填料，可有效將印跡技術(shù)的特異性吸附和固相萃取卓越的分離效率相結(jié)合，提高分離萃取能力[8-10]。

試驗(yàn)將通過紅外光譜分析，制備熊果酸印跡聚合物，考察其特異性吸附能力，將印跡聚合物與固相萃取技術(shù)相結(jié)合用于黃毛耳草中熊果酸的分離與富集。

1 儀器、設(shè)備與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀（IR Prestige-21，日本島津公司）、電子天平（FA 1004 N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高效液相色譜儀（LC-20 A，日本島津公司）、電熱恒溫水箱（CU 600，精慧智能儀表公司）、紫外可見分光光度計(jì)（UV 2550，日本島津公司）、數(shù)控超聲波清洗機(jī)（WTY 600，超聲功率600 W，頻率28 kHz，萬通超聲儀器設(shè)備廠）、臺(tái)式恒溫振蕩儀（THZ-22，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、固相萃取裝置（57044，Supelco）。

黃毛耳草（安國(guó)市云天中藥行）、熊果酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Z110742）、丙烯酸（AC，上海譜振生物科技有限公司）、偶氮二異丁腈（AIBN，上海譜振生物科技有限公司）、4-乙烯基吡啶（4-VP，百靈威科技有限公司）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，百靈威科技有限公司）、丙烯酸（天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所）、四氫呋喃（天津市康科德科技有限公司）、甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為二次蒸餾水。

2 試驗(yàn)內(nèi)容

2.1 聚合物的制備

精密稱取0.01 g熊果酸于1.50 mL四氫呋喃中，超聲使模板分子溶解，加入6.00 μL丙烯酸、83.00 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03 g偶氮二異丁腈，超聲混合，通氮?dú)?，密封，放入恒溫水浴箱反?yīng)12 h。取出聚合物粉碎，過120目篩，甲醇索式提取6 h，恒溫干燥90 min即得印跡聚合物（MIP）。

同樣方法制備空白聚合物（NIP）。

2.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

稱取40 mg MIP及NIP，各9份，分別加入不同濃度熊果酸甲醇溶液（濃度1～9 mmol·L-1），室溫振蕩平衡6 h，離心30 min，取適量上層清液，測(cè)定平衡溶液吸光度。用式（1）計(jì)算聚合物吸附量（Q），考察聚合物吸附性能。

式中：C0為初始濃度，mmol·L-1；C為吸附濃度，mmol·L-1；V為溶液的體積，mL；m為聚合物質(zhì)量，mg。

2.3 吸附選擇性試驗(yàn)

分別以熊果酸相似物白樺脂酸、羽扇豆醇為底物（結(jié)構(gòu)見圖1），考察熊果酸印跡聚合物吸附選擇性能。以乙腈為溶劑，配制0.2 mmol·L-1白樺脂酸、羽扇豆醇溶液，測(cè)定其紫外吸光度，計(jì)算吸附前后溶液濃度及聚合物對(duì)各底物的吸附量。

圖1 結(jié)構(gòu)式

2.4 分子印跡固相萃取黃毛耳草中的熊果酸

2.4.1 固相萃取柱的制備

取一根商品固相萃取柱（1 mL，100 mg），倒出吸附劑，柱體及濾板用甲醇超聲洗滌，稱取0.10 g的熊果酸聚合物加入柱中，用20 mL甲醇充分潤(rùn)濕平衡。

2.4.2 黃毛耳草粗提液的制備

將黃毛耳草晾曬干燥，粉碎，稱取10 g粗粉，用200 mL乙醇索氏提取2 h，過濾后濃縮至干，甲醇溶解即得。

2.4.3 黃毛耳草中熊果酸的萃取分離

將1 mL黃毛耳草提取液加入固相萃取柱中，用5 mL甲醇淋洗，5 mL甲醇-乙酸（8:2，V/V）溶液洗脫，流速為0.3 mL·min-1。流出液均干燥后用甲醇溶解，HPLC分析。分析條件：Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相為甲醇-水。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜試驗(yàn)

由圖2可知，紅外光譜中有羥基強(qiáng)峰（3 528 cm-1）、羧酸羰基（1 717 cm-1）、—CH3強(qiáng)峰（2 956 cm-1）和—CH2峰（2 922 cm-1）；并展示出熊果酸的典型結(jié)構(gòu)吸收峰，包括兩個(gè)基本骨架特征，即：熊果酸A區(qū)1 441，1 367和1 363 cm-1；熊果酸B區(qū)1 304，1 272和1 252 cm-1。聚合物的紅外譜圖在3 000 cm-1處的烷烴峰明顯減弱，在3 528 cm-1處的—OH峰明顯減弱，在1 717 cm-1處的—C==O峰也明顯減弱，表明熊果酸的羰基與羥基均參與了反應(yīng)；從圖2中還可以看出，由于形成了新的聚合物，熊果酸典型結(jié)構(gòu)吸收有所減弱或合并。圖3為印跡過程示意圖。

圖2 熊果酸（a）、熊果酸聚合物（b）紅外光譜

圖3 印跡過程示意圖

3.2 印跡聚合物吸附等溫線

如圖4所示，MIP吸附曲線呈先快速增加后趨于平衡的結(jié)合特點(diǎn)，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，MIP對(duì)熊果酸的吸附量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIP對(duì)熊果酸的吸附量。這表明與空白聚合物比較，所制備MIP對(duì)熊果酸具有更好的吸附性能，體現(xiàn)出良好的特異性吸附特點(diǎn)。

3.3 印跡聚合物吸附選擇性

為進(jìn)步一研究熊果酸分子印跡聚合物的吸附特性，使用了與熊果酸分子結(jié)構(gòu)相似的羽扇豆醇、白樺脂酸作為對(duì)照品，分別測(cè)定了熊果酸印跡聚合物對(duì)二者的吸附量，由結(jié)果可看出，熊果酸印跡聚合物對(duì)熊果酸分子的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)羽扇豆醇和白樺脂酸的吸附量，表現(xiàn)出良好的鎖鑰特點(diǎn)。同時(shí)可以看出，由于白樺脂酸與熊果酸結(jié)構(gòu)更相似，其吸附量大于羽扇豆醇。用a、ε參數(shù)進(jìn)一步說明結(jié)合特點(diǎn)，a為印跡聚合物和空白聚合物對(duì)熊果酸吸附量之比，其值越大，聚合物吸附效果越好；ε為印跡聚合物對(duì)熊果酸和對(duì)照品吸附量之比，值越大，聚合物吸附選擇性越好。由結(jié)果可知，熊果酸a為2.76，表示印跡聚合物具有良好的印記效果，相對(duì)于羽扇豆醇和白樺脂酸的ε均大于2，表現(xiàn)出較好的選擇性。

3.4 黃毛耳草中熊果酸的固相萃取試驗(yàn)

將所制備的熊果酸分子印跡聚合物用于黃毛耳草提取液的固相萃取。從圖5色譜圖可看出，黃毛耳草成分較為復(fù)雜，其中熊果酸含量較高。將1 mL黃毛耳草提取液加入印跡聚合物固相萃取柱，用甲醇進(jìn)行淋洗，從淋洗液色譜圖可以看出，淋洗液中基本檢不出熊果酸，說明印跡聚合物已將熊果酸選擇性吸附，熊果酸未進(jìn)入淋洗液；淋洗完畢，用乙酸、甲醇混合溶液對(duì)印跡聚合物萃取柱進(jìn)行洗脫，洗脫液中已無其他物質(zhì)，只檢出熊果酸。從分析結(jié)果可看出，制備的熊果酸分子印跡聚合物對(duì)熊果酸具有明顯的特異性吸附，吸附性能良好，可用于固相萃取填料實(shí)現(xiàn)對(duì)黃毛耳草中熊果酸的分離與富集。

圖4 聚合物對(duì)熊果酸吸附量

表1 聚合物對(duì)底物的選擇性

圖5 色譜圖

4 結(jié)論

以丙烯酸為單體，在乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯(lián)作用下合成了熊果酸分子印跡聚合物，經(jīng)過紅外光譜分析驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)，通過靜態(tài)吸附試驗(yàn)及選擇性能測(cè)試考察了聚合物對(duì)熊果酸的特異性吸附能力，結(jié)合固相萃取技術(shù)對(duì)黃毛耳草提取液進(jìn)行了進(jìn)一步的分離；結(jié)果表明，所制備的熊果酸分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)熊果酸具有較強(qiáng)的特異性選擇吸附性能，作為固相萃取吸附劑，可有效地對(duì)黃毛耳草中熊果酸進(jìn)行分離與富集?；谔禺愋宰R(shí)別性強(qiáng)、選擇性高、成本低等特點(diǎn)，熊果酸分子印跡聚合物與固相萃取、液相色譜等技術(shù)相結(jié)合，可廣泛應(yīng)用于中藥材中熊果酸的提取、樣品中痕量熊果酸富集與分析等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。