尹培培，劉昌衡，趙魯豫，劉永，張綿松，賈愛(ài)榮*

1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所（濟(jì)南 250103）；2. 菏澤巨鑫源食品有限公司（菏澤 274400）

蘆筍（Asparagus officinalis L.）又名石刁柏、龍須菜，為百合科天門(mén)冬屬多年生草本植物[1]，主要分為綠蘆筍和白蘆筍兩種。蘆筍含有人體不可或缺的氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，還含有膳食纖維、皂角苷類(lèi)及酚類(lèi)等多種生物活性成分[2]，具有抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抗疲勞等生物學(xué)功能[3-5]，因此深受人們的喜愛(ài)。

蘆筍含有豐富的膳食纖維，膳食纖維被稱(chēng)為繼水、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)、脂肪之外的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”，能有效減少和預(yù)防心腦血管疾病、肥胖、糖尿病、高血壓、便秘等疾病的發(fā)生[6]，具有抗氧化、清除自由基和提高人體免疫力等作用[7]。隨著人們飲食習(xí)慣的改變，各類(lèi)“文明病”不斷出現(xiàn)，膳食纖維的重要性逐漸被人們認(rèn)識(shí)。許多研究成果已被應(yīng)用到食品行業(yè)中[6]。通過(guò)酶法提取蘆筍膳食纖維，可以充分利用蘆筍資源，加快蘆筍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

此外，國(guó)內(nèi)外研究表明，蘆筍含有大量的黃酮類(lèi)化合物，主要為蘆丁、槲皮素、水仙苷、煙花苷等[8-9]，且蘆筍中黃酮含量高于一般蔬菜[10]。植物黃酮類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)清除體內(nèi)自由基、延緩人體衰老及各種心腦血管疾病等具有積極作用。然而，目前對(duì)兩種蘆筍中膳食纖維的酶法提取及可溶性膳食纖維、酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性的比較性研究匱乏。因此擬分別采用酶解和超聲輔助的方式提取白蘆筍和綠蘆筍中的膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)，并比較兩種蘆筍中可溶性膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性，以期為衡量蘆筍的食用和藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)，為綠蘆筍和白蘆筍的深度開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠蘆筍和白蘆筍由菏澤巨鑫源食品有限公司提供。采集新鮮的白蘆筍和綠蘆筍，清水洗凈基部污垢，立即放入105 ℃烘箱15 min進(jìn)行滅酶，然后置于50 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量。采用中藥粉碎機(jī)將樣品粉碎，保存至-20 ℃冰箱備用。

2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、6-羥基-2, 5, 7, 8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（水溶性維生素E；Trolox）、福林酚溶液、脂肪酶等均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；中溫淀粉酶（中溫LT型）、糖化酶CN4型、中性蛋白酶購(gòu)自丹麥DANISCO（丹尼斯克）公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

5804 R型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)艾本德；DHG-9070 A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HHS 21-4-S型水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；NPCA-02型氮磷鈣測(cè)定儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；Infinite M 200 Pro型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN；KQ-400 KDE型超聲波提取儀，江蘇昆山超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆筍中可溶性膳食纖維及不可溶性膳食纖維的提取

稱(chēng)取綠蘆筍和白蘆筍粉末各80 g于錐形瓶中，分別加入2 400 mL蒸餾水和25 g脂肪酶，在pH為9.0，40℃條件下作用2 h除脂肪并滅酶；將兩種樣品于100 ℃糊化15 min，在pH為6.0，70 ℃條件下，加600 mL α-淀粉酶（中溫LT型）反應(yīng)1 h除淀粉并滅酶；繼續(xù)加入48 mL糖化酶，在pH為4.75，60 ℃條件下作用2 h，滅酶；最后加入48 mL中性蛋白酶，在pH為6.99，50℃條件下作用1 h。

將上述樣品于8 000 r/min離心15 min，上清液加入4倍體積無(wú)水乙醇沉淀，靜置過(guò)夜，離心，將沉淀烘干即得可溶性膳食纖維，分別為白蘆筍可溶性膳食纖維（W-SDF）和綠蘆筍可溶性膳食纖維（G-SDF）；沉淀用蒸餾水清洗3遍后，于50 ℃烘干即得不可溶性膳食纖維，分別為白蘆筍不可溶性膳食纖維（W-IDF）和綠蘆筍不可溶性膳食纖維（G-IDF）。

1.2.2 蘆筍膳食纖維的基本理化指標(biāo)測(cè)定

淀粉含量測(cè)定，GB 5009.9—2008食品中淀粉的測(cè)定；脂肪含量測(cè)定，GB 5009.6—2016索氏提取法；蛋白含量測(cè)定，GB 5009.6—2016凱氏定氮法；灰分含量測(cè)定，GB 5009.6—2016高溫灼燒法。

1.2.3 蘆筍酚類(lèi)物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取每份為1.000 g的蘆筍樣品，各3份，置于50 mL離心管中，分別加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液，搖勻，置于超聲波提取儀中超聲提取30 min，冷卻至室溫，過(guò)濾；殘?jiān)貜?fù)以上步驟提取兩次，合并三次濾液即得。此溶液用于測(cè)定兩種蘆筍中酚類(lèi)物質(zhì)含量及其抗氧化活性，分別為白蘆筍總酚（W-TF）和綠蘆筍總酚（G-TF）。

1.2.4 總酚含量的測(cè)定

將40 μL福林酚溶液加到96孔板中，再加入20 μL樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻；室溫孵育5 min，加入140 μL的Na2CO3溶液，混合均勻；置于40 ℃烘箱中避光孵育30 min后，于765 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置三次重復(fù)。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算被測(cè)樣品溶液中沒(méi)食子酸濃度當(dāng)量，總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量（Gallic acid equivalent，GAE）表示，結(jié)果表達(dá)為mg GAE/g干質(zhì)量。

1.2.5 總黃酮含量測(cè)定

將120 μL樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)品溶液加到96孔板中，加入8 μL亞硝酸鈉溶液，混合均勻，室溫孵育6 min，加入8 μL的AlCl3溶液，混合均勻，室溫孵育5 min，最后加入100 μL的NaOH溶液混勻，室溫避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀于410 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)三次。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算被測(cè)樣品溶液中蘆丁濃度當(dāng)量，總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量（Rutin equivalent，RE）表示，表達(dá)為mg RE/g干質(zhì)量。

1.2.6 蘆筍中可溶性膳食纖維及酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定

1.2.6.1 DPPH抗氧化能力

將10 μL的Trolox、樣品及空白溶液加到96孔板中，加入40 μL新鮮配制的DPPH甲醇溶液，混合均勻后加入190 μL的甲醇溶液，以200 r/min振搖1 min；室溫避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)三次。自由基清除活性RSA=（AO-AS）/AO×100%，AS為樣品溶液吸光度，AO為空白溶液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算DPPH自由基清除能力。結(jié)果表示為T(mén)rolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干質(zhì)量。

1.2.6.2 ABST抗氧化能力

將5 μL的Trolox、樣品及空白溶液加到96孔板中，再加入200 μL新鮮配制的ABTS+·工作液，室溫避光孵育5 min。用酶標(biāo)儀于734 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)三次。自由基清除活性RSA=（AO-AS）/AO×100%，AS為樣品溶液吸光度，AO為空白溶液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算ABTS自由基清除能力。結(jié)果表示為T(mén)rolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干質(zhì)量。

1.2.6.3 還原力

準(zhǔn)確量取0.4 mL待測(cè)樣品溶液或空白溶液，再加入1 mL磷酸緩沖液及1 mL鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）溶液，混合均勻，于50 ℃水浴孵育20 min；再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，室溫孵育10 min。取1 mL上述溶液，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，均勻混合，用分光光度計(jì)于700 nm處測(cè)定吸光度。溶液的吸光度越高，還原力越強(qiáng)，反之越弱。結(jié)果表示為T(mén)rolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干質(zhì)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），試驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)的顯著性差異（t檢驗(yàn)：等方差雙尾檢驗(yàn)）采用Microsoft Excel數(shù)據(jù)分析軟件（Microsoft Office Excel 2016，Microsoft Corp. Redmond，WA，USA）。p＜0.05差異顯著，p＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍中可溶性膳食纖維及不可溶性膳食纖維含量

膳食纖維作為一種功能性食品配料具有多種生物功效，其制備和生物活性研究已成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)[11]。膳食纖維常用的提取方法有酶法、酶-化學(xué)法、酸堿法、微生物發(fā)酵法以及物理法等[12-13]。酶法提取條件溫和，安全無(wú)毒，節(jié)約能耗，操作方便，利于工業(yè)化生產(chǎn)，且對(duì)環(huán)境污染少。因此研究采用酶法制備蘆筍中的可溶性膳食纖維及不溶性膳食纖維。由圖1可知，白蘆筍和綠蘆筍中都含有豐富的可溶性和不可溶性膳食纖維，且兩種蘆筍中可溶性膳食纖維的含量均顯著高于其自身的不可溶性膳食纖維的含量；綠蘆筍中兩種膳食纖維的含量均分別高于白蘆筍中兩種膳食纖維的含量，其含量從高到低依次為：G-SDF＞W(wǎng)-SDF＞G-IDF＞W(wǎng)-SDF。研究采用的白蘆筍和綠蘆筍為同一品種，其唯一區(qū)別在于綠蘆筍經(jīng)過(guò)正常光合作用呈現(xiàn)出綠色，而白蘆筍在整個(gè)生長(zhǎng)周期里全部在地底下，避光生長(zhǎng)，口感細(xì)膩。因此推測(cè)，光照有利于蘆筍中兩種膳食纖維的合成。

2.2 綠蘆筍及其膳食纖維的理化指標(biāo)

表1為綠蘆筍及其兩種膳食纖維的理化指標(biāo)值。從表1中可知，蘆筍樣品中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪及灰分的總量占蘆筍干質(zhì)量的39.632%，而不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪及灰分的總量分別占其干質(zhì)量的10.478%和21.6%，這說(shuō)明通過(guò)酶法提取的兩種蘆筍膳食纖維純度較高，可作為高純度膳食纖維用于食品添加劑等方面。

圖1 白蘆筍和綠蘆筍不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維提取率

表1 綠蘆筍及其兩種膳食纖維的理化指標(biāo)

2.3 蘆筍中總酚和總黃酮的含量

2.3.1 沒(méi)食子酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

為了準(zhǔn)確測(cè)定蘆筍中總酚和總黃酮的含量，分別建立沒(méi)食子酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。圖2（A）為測(cè)定總酚所用的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為：y=0.005 4x+0.085 8，R2=0.996 6，表明沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好；圖2（B）為測(cè)定總黃酮所用的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為：y=0.003 7x+0.048 8，R2=0.999 4，表明蘆丁質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖2 測(cè)定總酚和總黃酮所建立的沒(méi)食子酸和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3.2 蘆筍中總酚及總黃酮含量

圖3為白蘆筍和綠蘆筍中總酚和總黃酮的含量。由圖3可知，綠蘆筍總酚和總黃酮的含量均顯著高于白蘆筍，白蘆筍中總酚和總黃酮的含量分別為2.89±0.16 mg GA/g和10.45±0.43 mg RE/g，綠蘆筍中總酚和總黃酮的含量分別為6.76±0.43 mg GA/g和23.12±0.50 mg RE/g。在自然界中，黃酮類(lèi)化合物是大多數(shù)植物體自身存在的一類(lèi)最主要的抗紫外的化合物，它能夠有效吸收紫外線(xiàn)，使植物體器官組織，尤其是光合作用組織免受或少受輻射損害[14]。因此推測(cè)光照有利于蘆筍中黃酮類(lèi)化合物的合成，從而導(dǎo)致綠蘆筍中總酚及總黃酮含量均高于白蘆筍。

2.4 蘆筍可溶性膳食纖維及酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性

2.4.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

植物中存在的酚類(lèi)物質(zhì)，如黃酮、酚酸及單寧等，是其發(fā)揮抗氧化活性的主要因素[15]。研究表明，不同抗氧化劑存在不同的抗氧化機(jī)制，因此單一的抗氧化方法很難全面反映包含多種化合物的植物提取物的抗氧化能力[16-17]。為了準(zhǔn)確測(cè)定各樣品的抗氧化活性，采用了DPPH及 ABTS自由基清除能力和還原力測(cè)定三種試驗(yàn)方法。DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力的Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別如圖（圖4）所示：y=0.190 6x+1.410 3，R2=0.994 6；y=0.220 2x+2.747 1，R2=0.994 6；y=0.002 1x+0.055 2，R2=0.998 9，且Trolox質(zhì)量濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 白蘆筍和綠蘆筍總酚和總黃酮含量

圖4 DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力的Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4.2 蘆筍可溶性膳食纖維及酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化活性

2.4.2.1 DPPH自由基清除活性

四種樣品的DPPH自由基清除能力如圖5所示。自由基的清除能力變化越快，表示物質(zhì)的氫原子供給能力越強(qiáng)[18]。結(jié)果顯示，綠蘆筍中可溶性膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)的DPPH自由基清除能力分別顯著高于白蘆筍；白（綠）蘆筍酚類(lèi)物質(zhì)的DPPH自由基清除能力顯著比可溶性膳食纖維強(qiáng)；白蘆筍中可溶性膳食纖維 DPPH自由基清除能力最弱，基本為零，而綠蘆筍酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力最強(qiáng)，白蘆筍酚類(lèi)物質(zhì)與綠蘆筍可溶性膳食纖維的DPPH自由基清除能力沒(méi)有顯著性差異。

2.4.2.2 ABTS自由基清除活性

圖6為四種樣品的ABTS自由基清除能力。四種樣品的ABTS抗氧化能力顯著不同，且綠蘆筍的ABTS自由基清除能力顯著高于白蘆筍，酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性高于可溶性膳食纖維，即W-SDF＜W-TF＜G-SDF＜G-TF。

2.4.2.3 還原力

四種樣品的還原能力如圖7所示，其還原力與ABTS自由基清除能力趨勢(shì)基本一致，且綠蘆筍的抗氧化活性高于白蘆筍，酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性高于可溶性膳食纖維，即W-SDF＜W-TF＜G-SDF＜G-TF。

通過(guò)比較兩種蘆筍中可溶性膳食纖維、總酚、總黃酮的含量及三種抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，樣品的抗氧化活性與其活性物質(zhì)的含量趨勢(shì)相同。初步推測(cè)，蘆筍中酚類(lèi)物質(zhì)是其抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者，且蘆筍抗氧化能力的強(qiáng)弱與其總酚和可溶性膳食纖維的含量有關(guān)，總酚和可溶性膳食纖維的含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)；光照有利于植物抗氧化物質(zhì)的合成。

圖6 白蘆筍和綠蘆筍的可溶性膳食纖維及其酚類(lèi)物質(zhì)的ABTS自由基清除活性

圖7 白蘆筍和綠蘆筍的可溶性膳食纖維及其酚類(lèi)物質(zhì)的還原力

3 結(jié)論

分別采用酶法和超聲波輔助提取兩種蘆筍中的膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)。結(jié)果顯示：綠蘆筍中可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維、總酚和總黃酮的含量均分別顯著高于白蘆筍中的含量。經(jīng)過(guò)酶法提取后，蘆筍的可溶性和不可溶性膳食纖維的純度高，有利于作為一種高純度的膳食纖維添加劑?？寡趸芰Y(jié)果顯示：綠蘆筍的可溶性膳食纖維和酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性均顯著高于白蘆筍，且蘆筍酚類(lèi)物質(zhì)是其抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者。綜上所述，蘆筍，尤其是綠蘆筍，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且是一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維的來(lái)源，這為蘆筍的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。