林巍，翟麗萍，劉曉蘭，孫美佳

齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）

蕓豆是豆科菜豆屬小宗雜糧，是世界上主要栽培的豆類作物之一。我國蕓豆種植面積廣，產(chǎn)量高，品種資源豐富。黑龍江省是我國蕓豆的主要產(chǎn)區(qū)之一，年出口總量占全國的近1/2[1]。蕓豆富含淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維、花色苷等物質(zhì)，其中蛋白含量達20.29%～27.73%，包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白等，其中清蛋白含量最高[2]；蕓豆清蛋白中含有18種氨基酸，氨基酸總量達85.30%，其中谷氨酸含量最高，其次是天門冬氨酸，氨基酸比例合理，具有較高營養(yǎng)價值[3]。但是目前蕓豆蛋白利用率相對較低，主要因為其分離蛋白具有相對較差的功能特性，限制了這類蛋白資源在食品加工中的應用。研究表明蕓豆蛋白酶水解后會改善其功能性質(zhì)[4-5]，釋放特殊的生理活性，如抗氧化活性[6-8]。蕓豆是一種潛在的優(yōu)質(zhì)豆類蛋白資源，因此，試驗主要對酶解前后紫花蕓豆清蛋白的功能性質(zhì)變化情況進行了研究，為蕓豆蛋白在食品工業(yè)上的應用奠定基礎(chǔ)，也為蕓豆資源深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

基金項目：黑龍江省省屬高等學?；究蒲袠I(yè)務(wù)費科研項目（YSTSXK201822）；黑龍江省教育廳科研創(chuàng)新團隊項目（135309113）；黑龍江省教育廳基本業(yè)務(wù)專項糧頭食尾（LTSW201717）

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黑龍江紫花蕓豆，市售，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)23.77%；DPPH、ABTS，均購于Sigma公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶，購于上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，購于上海生工；其他試劑等均為國產(chǎn)分析純。

T-114分析天平，美國丹佛；水浴恒溫振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械廠；紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機，美國Sim公司；CF 15 RXII高速離心機，日本日立公司；En Spire全波長多功能酶標儀，美國珀金埃爾默公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花蕓豆清蛋白的提取

將紫花蕓豆浸泡后手工脫皮，50 ℃烘干，粉碎過篩，得蕓豆粉。1份蕓豆粉加15份蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液pH為8，50 ℃振蕩提取3 h，冷卻后12 000 r/min離心30 min。取上清液，用鹽酸調(diào)至pH 4.8，以5 000 r/min再離心20 min。取沉淀，用pH 4.8的去離子水洗2次，pH 7水復溶，以3 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，備用。

1.2.2 不同蛋白酶酶解效果比較

使用4種商業(yè)蛋白酶（木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶）對蕓豆清蛋白進行了酶解，通過比較水解度和水解產(chǎn)物中蛋白變化確定最適酶。

1.2.3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白功能性質(zhì)影響

1.2.3.1 紫外光譜掃描

缺硼：幼苗子葉和真葉發(fā)紫，葉片僵而脆。莖生長點發(fā)黑、干枯，在生長點附近長出新的側(cè)枝。整個植株呈叢生狀。頂端的枝條向內(nèi)卷曲，發(fā)黃而死，葉片、葉柄及中脈都變脆。

取濃度為0.1%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液，分別在200～800 nm范圍用多功能酶標儀掃描，平行測定3組試驗。

1.2.3.2 起泡性能的測定

分別配置濃度為2%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液，各取50 mL，用均質(zhì)機以10 000 r/min攪打2 min，然后測定泡沫體積，記為V1（mL）。靜置10，20和30 min之后，再次測定泡沫的體積V2（mL），記為泡沫穩(wěn)定性。

1.2.3.3 乳化性能的測定

分別配置濃度為3%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液各50 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入50 mL大豆油，再均質(zhì)5 min，迅速將乳化液倒入100 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，測量乳化層體積。上述方法所得混合液放置于80 ℃的水浴鍋中保溫30 min，冷卻至室溫后再以3 000 r/min在離心機中離心5 min，取出后測量乳化層的體積（mL）。計算樣品的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。

1.2.3.4 吸油性的測定

稱取0.5 g木瓜蛋白酶酶解物、堿性蛋白酶酶解物、清蛋白，分別和10 mL大豆油于離心管中混勻，室溫靜置30 min，然后以8 000 r/min離心30 min，測定上清液體積，體積減少量即為樣品吸油量。吸油性表示為每克樣品的吸附油體積，平行3組試驗。

將樣品蛋白濃度配制為40 μg/mL，用于ABTS自由基清除能力測定。將配好的ABTS自由基儲備液，用PBS稀釋到A734=0.7±0.2，作為ABTS自由基工作液。在96孔酶標板的每孔中加入100 μL各樣品溶液，再加入100 μL的ABTS自由基工作液，用PBS代替樣品作為對照A0，每個樣品設(shè)6個重復，搖勻后黑暗中靜置50 min在734 nm波長下測定吸光度。

1.2.3.6 DPPH自由基清除率的測定

將紫花蕓豆清蛋白、兩種酶解物以及膜分離各組分的蛋白濃度配制為1 mg/mL，采用微量法測定DPPH自由基清除率。取100 μL上述樣品于96孔板中，再加入100 μL濃度為0.04 g/L的DPPH自由基無水乙醇溶液，混合均勻，避光反應50 min后，在517 nm處測其吸光度為Ai；另取100 μL待測樣品，加100 μL無水乙醇，測定吸光度Aj；以100 μL 0.04 g/L的DPPH自由基無水乙醇溶液和100 μL無水乙醇反應作為參比，其吸光度為A0。所有的測量都需要平行6次。DPPH自由基清除率計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 四種蛋白酶對紫花蕓豆清蛋白水解度的影響

由圖1可知，采用四種蛋白酶水解紫花蕓豆清蛋白，堿性蛋白酶的水解度最大，其次是木瓜蛋白酶，而復合蛋白酶和中性蛋白酶的水解較差，都低于5%。圖2為四種蛋白酶水解2 h后的蛋白電泳圖譜。由圖2可以看出，水解前的紫花蕓豆清蛋白分子量主要集中在45 kDa，此外在25和70 kDa左右還有三條明顯的條帶。復合蛋白酶和中性蛋白水解后，70 kDa的兩條亞基降解了，但其他亞基沒有變化；而木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解后，水解液中基本上觀察不到18 kDa以上的蛋白條帶，表明水解效果較好。

圖1 四種蛋白酶對紫花蕓豆清蛋白水解度的影響

圖2 酶解前后蛋白質(zhì)變化情況

2.2 酶解對紫花蕓豆清蛋白功能性質(zhì)的影響

2.2.1 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的紫外光譜掃描

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團對紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基側(cè)鏈基團對紫外光的吸收。由圖3可知，兩種酶解均可提高紫花蕓豆清蛋白的紫外吸收，兩個吸收峰分別位于235和280 nm附近。經(jīng)過酶解作用的紫花蕓豆清蛋白，肽鏈長度發(fā)生變化，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，內(nèi)部的生色基團暴露出來，導致紫外吸收增強。

圖3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的紫外光譜掃描

2.2.2 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性

由圖4和圖5可知，酶解提高了紫花蕓豆清蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性；其中木瓜蛋白酶效果優(yōu)于堿性蛋白酶。蛋白分子中含有親水基團和疏水基團，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時可形成泡沫。蛋白質(zhì)的起泡活性和溶解度是呈正相關(guān)的，這是由于溶解度提高有助于蛋白擴散在油/水和氣/水界面，起泡性也得到了改進。酶解提高了蕓豆清蛋白的溶解性，其起泡性也隨之增加。

圖4 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的起泡性

圖5 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的泡沫穩(wěn)定性

2.2.3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性

由圖6可知，酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性沒有顯著性改變。蛋白質(zhì)的溶解度、疏水性、擴散到界面的速率、分子間相互作用、表面電荷和水合度等因素皆可影響乳化性。酶解可改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，使原先埋藏于分子內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露于溶液，表面疏水性和表面電荷增加，提高了蛋白的乳化性，但是隨著肽鍵的水解，使蛋白質(zhì)分子量進一步減低，逐漸失去表面活性作用，又可降低蛋白的乳化性。所以雖然酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性沒有改變，但其實是多因素綜合作用的結(jié)果。

圖6 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性

2.2.4 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的吸油性

由圖7可以看出，酶解前后蕓豆清蛋白的吸油性存在顯著性差異，酶解降低了紫花蕓豆清蛋白的吸油性。蛋白質(zhì)肽鍵水解，分子量降低，疏水性較弱，與油結(jié)合機會減少。所以其吸油性產(chǎn)生了下降的現(xiàn)象。

圖7 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的吸油性

2.2.5 酶解對蕓豆清蛋白抗氧化活性的影響

由圖8可知，酶解前蕓豆清蛋白的抗氧化活性較弱，酶解可使其抗氧化活性顯著升高。與未酶解的蕓豆蛋白相比，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解物的ABTS和DPPH自由基清除能力顯著升高，其中木瓜蛋白酶解產(chǎn)物的ABTS和DPPH自由基清除率都優(yōu)于堿性蛋白酶，尤其木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物ABTS自由基清除率，由原來酶解前的17%提高到73%，所以木瓜蛋白酶更適合制備蕓豆抗氧化活性肽。

圖8 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的抗氧化活性

3 結(jié)論

4種商業(yè)蛋白酶中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解效果較好；酶解后紫花蕓豆清蛋白的抗氧化活性、起泡性及起泡穩(wěn)定性明顯提高；紫外吸收增強；但吸油性明顯降低，乳化性及其穩(wěn)定性沒有變化；酶解后的紫花蕓豆清蛋白更有利于其在食品加工及功能性食品研發(fā)方面的應用。