周金虎，毛志海，陳茂彬，方尚玲*

1. 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北工業(yè)大學(xué)），工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢 430068）；2. 湖北華信制藥有限公司（咸寧 437400）

白酒是中國(guó)的國(guó)酒，歷經(jīng)千百年傳承仍被現(xiàn)代人所青睞，這不僅是中國(guó)白酒魅力所在，同時(shí)也是中國(guó)白酒健康價(jià)值的體現(xiàn)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，茅臺(tái)酒有預(yù)防肺癌、淺表性胃炎等疾病的功效[2]。愈創(chuàng)木酚作為白酒中健康因子之一，越來(lái)越強(qiáng)引起科研工作者的關(guān)注。研究表明，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是良好的自由基清除劑，具有較好的活性氧消除功能，可抗氧和預(yù)防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有預(yù)防疾病、抗衰老、促進(jìn)人體健康的作用[3]。

香草酸脫羧酶是愈創(chuàng)木酚生成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶，香草酸在香草酸脫羧酶的催化下非氧化脫羧生成愈創(chuàng)木酚[4]。通過(guò)對(duì)該酶性質(zhì)的研究，可以更加深入地認(rèn)識(shí)愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生，也為愈創(chuàng)木酚的代謝調(diào)控提供參考。截至目前，對(duì)香草酸脫羧酶相關(guān)的研究很少有文獻(xiàn)報(bào)道。因此試驗(yàn)以篩選到的Delftia sp. X-a12為供試菌株，考察不同單因素對(duì)細(xì)胞超聲破碎的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)綜合考慮各因素對(duì)細(xì)胞超聲破碎的影響，以期為基于酶活代謝調(diào)控的控制提供方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：從黃鶴樓濃香型酒廠篩選到的Delftia sp. X-a12。

香草酸（＞98%，上海麥克林生化科技有限公司）；愈創(chuàng)木酚（＞98%，色譜純，美國(guó)Aladdin工業(yè)公司）；無(wú)水乙醇（≥99.8%，色譜純，美國(guó)Aladdin工業(yè)公司）；NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等。

發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、(NH4)2SO40.04%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCl2·2H2O 0.05%、KH2PO40.12%、MnSO4·H2O 0.05%、0.5 mmol/L香草酸，在pH自然，121 ℃下滅菌30 min。

1.2 儀器和設(shè)備

SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；X1R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；TB-214電子分析天平（d=0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；85-2 A數(shù)顯恒溫磁力攪拌（金壇市科析儀器有限公司）；YM 30 Z立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取一環(huán)Delftia sp. X-a12菌泥于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

將種子液按2%的接種量接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h測(cè)定其在600 nm處的吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長(zhǎng)曲線，確定菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.3 超聲波細(xì)胞破碎[4]

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Delftia sp. X-a12菌懸液30 mL（離心管50 mL）在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清，用pH 6.5 20 mmol/L磷酸緩沖液洗滌菌體，離心棄上清，洗滌菌體離心棄上清，按菌體質(zhì)量濃度0.10 g/mL懸浮于pH 6.5 20 mmol/L磷酸緩沖液中，在一定條件下進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，在14 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，收集上清即為粗酶液。

1.3.4 香草酸脫羧酶酶活測(cè)定

檢測(cè)香草酸脫羧酶脫羧活性反應(yīng)體系為：0.5 mmol/L香草酸和粗酶液6 mL，在45 ℃、120 r/min條件下反應(yīng)1 h后，用GC-MS檢測(cè)愈創(chuàng)木酚的含量。以熱滅活的對(duì)應(yīng)酶（121 ℃、20 min）作為空白對(duì)照。

一個(gè)酶活單位（U）定義為1 min生成1 ng愈創(chuàng)木酚所需的酶量，酶比活力定義為以香草酸為底物，1 mL粗酶液每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 ng愈創(chuàng)木酚所需的酶量為1個(gè)酶比活力單位，以U/mL來(lái)表示。

愈創(chuàng)木酚含量采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量檢測(cè)。

樣品處理：取反應(yīng)溶液1 mL，加入NaCl直至飽和，頂空固相微萃取20 min。氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）氣相色譜。進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。不分流進(jìn)樣。升溫程序?yàn)椋?0 ℃，保持0 min，再以20 ℃/min升溫至150 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持5 min。溶劑延遲5 min[5]。

質(zhì)譜條件：電子電離（EI）源，采集類型SIM掃描。電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍50.00～600.00 m/z。

1.3.5 超聲波破碎單因素試驗(yàn)[6]

將超聲波破碎處理的各基礎(chǔ)參數(shù)值設(shè)為：輸出功率300 W，每次輻射時(shí)間3 s，間歇時(shí)間5 s（固定不變）、工作總時(shí)間10 min、菌體質(zhì)量0.1 g/mL，并固定每次菌懸液的處理體積為30 mL，分別考察超聲波輸出功率（200，300，400，500和600 W）、工作總時(shí)間（2，5，10，15和20 min）和菌體質(zhì)量濃度（0.020，0.025，0.030，0.050，0.10和0.20 g/mL）對(duì)香草酸脫羧酶提取效果的影響。

1.3.6 超聲波破碎響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[7]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以輸出功率（A）、處理總時(shí)間（B）和菌體質(zhì)量濃度（C）為考察因子，以香草酸脫羧酶酶活（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平編碼值見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平編碼表

1.3.7 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀和透析[8-10]

向8個(gè)分別裝有25 mL粗酶液的小燒杯中緩慢加入干燥并研磨后的(NH4)2SO4（冰水浴條件下進(jìn)行，邊攪拌邊加入），使其飽和度分別為20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%，于4 ℃下分別靜置8 h，在14 000 r/min、4 ℃條件下分別離心30 min，棄上清，沉淀分別用預(yù)冷的緩沖液溶解后，置于透析袋中，并在緩沖液中分別透析過(guò)夜（4 ℃，磁力攪拌），分別測(cè)定其中香草酸脫羧酶酶比活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線繪制

細(xì)菌的生長(zhǎng)一般分為4個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期及衰亡期[11-12]。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，Delftia sp. X-a12在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

1620年，一艘載有100多人的船橫渡大西洋來(lái)到新大陸定居。這個(gè)宗教團(tuán)體在英國(guó)開(kāi)始質(zhì)疑教會(huì)的信仰，所以想與之分離。朝圣者在現(xiàn)在的馬薩諸塞州定居。他們?cè)谛麓箨懙牡谝粋€(gè)冬天過(guò)得很艱難。他們來(lái)得太晚了，不能種更多的莊稼，沒(méi)有新鮮食物，一半的人死于疾病。第二年春天，易洛魁族印第安人教他們?nèi)绾畏N植玉米，這是殖民者的新食物，告訴他們?nèi)绾卧谶@陌生的大地種植其他作物，以及如何捕獵和捕魚(yú)。

Delftia sp. X-a12的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為6～18 h，由文獻(xiàn)得知香草酸脫羧酶是一種誘導(dǎo)酶，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)代謝產(chǎn)香草酸脫羧酶量最多，所以選擇培養(yǎng)18 h的菌懸液進(jìn)行細(xì)胞破碎。

圖1 Delftia sp. X-a12的生長(zhǎng)曲線

2.2 超聲波破碎單因素試驗(yàn)

2.2.1 輸出功率對(duì)細(xì)胞破碎的影響

固定超聲波輻射時(shí)間3 s、間歇時(shí)間5 s、工作總時(shí)間20 min、菌體質(zhì)量濃度0.10 g/mL，考察超聲波輸出功率對(duì)香草酸脫羧酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

香草酸脫羧酶活性隨輸出功率的增大先升高后降低，500 W時(shí)達(dá)到最大，為5.50 U/mL。這是因?yàn)槌暪β蔬^(guò)小，不能有效破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)酶，增大輸出功率，有利于空化泡的形成，從而增強(qiáng)破碎效果，但輸出功率過(guò)大，則會(huì)引起細(xì)胞懸液局部溫度和壓力過(guò)高，導(dǎo)致胞內(nèi)酶失活[6-7]。因此選定輸出功率為500 W。

2.2.2 處理總時(shí)間對(duì)細(xì)胞破碎的影響

固定超聲波輻射時(shí)間3 s、間歇時(shí)間5 s、菌體質(zhì)量濃度0.10 g/mL、輸出功率500 W，考察處理總時(shí)間對(duì)香草酸脫羧酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

隨著處理總時(shí)間的延長(zhǎng)，香草酸脫羧酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)，在15 min時(shí)達(dá)到最大，為55.41 U/mL。這是因?yàn)樘幚砜倳r(shí)間過(guò)短，不能有效破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)酶，增加處理總時(shí)間，有利于空化泡的形成，從而增強(qiáng)破碎效果，但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞懸液局部溫度和壓力過(guò)高，使得菌液出現(xiàn)較多泡沫，導(dǎo)致酶失活和變性，同時(shí)由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞過(guò)于破碎，導(dǎo)致大量雜蛋白和其他雜質(zhì)被提取出來(lái)，增加后續(xù)分離純化目標(biāo)蛋白的難度[13]。因此選定處理總時(shí)間為15 min。

圖2 超聲波輸出功率對(duì)香草酸脫羧酶活性的影響

圖3 處理總時(shí)間對(duì)香草酸脫羧酶活性的影響

2.2.3 菌體質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞破碎的影響

隨著菌體質(zhì)量濃度增加，香草酸脫羧酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)，0.10 g/mL時(shí)達(dá)到最大，為13.36 U/mL。這是因?yàn)榧?xì)胞濃度低時(shí)，菌液的黏度下降，有利于細(xì)胞的破碎，但總體酶活較低，細(xì)胞濃度高時(shí)，菌液黏度增大，不利于空化泡的形成和爆炸，破碎效果反而下降，所以選擇菌體質(zhì)量濃度0.10 g/mL較為合適。

圖4 菌體質(zhì)量濃度對(duì)香草酸脫羧酶活性的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果[14]

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，不同試驗(yàn)因素對(duì)香草酸脫羧酶酶比活力的影響有所不同。為了優(yōu)化超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力的最佳條件，以中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理為依據(jù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，共設(shè)計(jì)17次試驗(yàn)，12次為析因試驗(yàn)，5次中心試驗(yàn)，Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出響應(yīng)面回歸方程為：Y=11.87-65.95A+53.33B+96.91C+144.89AB-85.07AC+93.43BC+156.83A2+128.54B2-4.12C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，根據(jù)F值各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響次序?yàn)镃＞A＞B，即菌體質(zhì)量濃度＞輸出功率＞處理總時(shí)間。建立的模型p=0.000 5＜0.01，模型極顯著。失擬項(xiàng)p=0.071 2＞0.05，表示純誤差不顯著。其中一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2均呈極顯著，說(shuō)明相關(guān)因素對(duì)超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力影響較大。決定系數(shù)R2=0.957 5，表明超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合度。校正決定相關(guān)系數(shù)R2adj=0.902 8，表明模型中各因素對(duì)香草酸脫羧酶酶比活力變化情況。因此，該模型有效，可用來(lái)預(yù)測(cè)分析各因素對(duì)香草酸脫羧酶酶比活力的影響。

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確定輸出功率、處理總時(shí)間、菌體質(zhì)量濃度對(duì)超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力的影響，響應(yīng)面曲面和等高線見(jiàn)圖5。

由圖5可知，輸出功率與處理總時(shí)間交互作用、輸出功率與菌體質(zhì)量濃度交互作用、處理總時(shí)間與菌體質(zhì)量濃度交互作用的顯著性情況與表3中交互項(xiàng)p值的分析結(jié)果一致。響應(yīng)面的坡度較為陡峭，表明香草酸脫羧酶酶比活力對(duì)輸出功率與處理總時(shí)間、輸出功率與菌體質(zhì)量濃度、處理總時(shí)間與菌體質(zhì)量濃度的變化較為敏感。在輸出功率不變的條件下，隨著處理總時(shí)間延長(zhǎng)，香草酸脫羧酶酶比活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其他交互因素同上。

等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。等高線呈橢圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較強(qiáng)，影響顯著[14]。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析，提高超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力的最佳條件為：超聲波輸出功率450 W、處理總時(shí)間18 min、菌體質(zhì)量濃度0.12 g/mL，此條件下香草酸脫羧酶酶比活力的理論值為542.86 U/mL。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳條件下，即超聲波輸出功率450 W、處理總時(shí)間18 min、菌體質(zhì)量濃度0.12 g/mL進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的平均香草酸脫羧酶酶比活力為541.27 U/mL。試驗(yàn)值與理論值相近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波細(xì)胞破碎粗酶液中香草酸脫羧酶酶比活力是可行的[15]。

2.4 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀分析

利用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀的方法對(duì)超聲波細(xì)胞破碎處理獲得的粗酶液進(jìn)行純化，結(jié)果如圖6所示。

香草酸脫羧酶主要集中在(NH4)2SO4飽和度50%～70%范圍內(nèi)，(NH4)2SO4飽和度達(dá)到60%時(shí)，酶比活達(dá)到最大，為633.34 U/mL，相當(dāng)于粗酶液純化倍數(shù)提高了1.17。而蔡瑞[4]使用80%飽和度的(NH4)2SO4沉淀A.acidoterrestris DSM 3923中的香草酸脫羧酶，這可能是由于該類酶的來(lái)源不同，所以性質(zhì)也有所不同。

圖5 輸出功率、處理總時(shí)間與菌體質(zhì)量濃度交互作用對(duì)香草酸脫羧酶酶比活力影響的響應(yīng)面與等高線

圖6 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀對(duì)香草酸脫羧酶酶比活力的影響

3 結(jié)論

以前期從黃鶴樓濃香型酒廠窖泥中篩選到的Delftia sp. X-a12為基礎(chǔ)，采用超聲波破碎法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎獲得香草酸脫羧酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，獲得香草酸脫羧酶酶活較高的提取條件：超聲波輸出功率450 W、處理總時(shí)間18 min、菌體質(zhì)量濃度0.12 g/mL。此條件下香草酸脫羧酶酶比活力為541.27 U/mL。對(duì)粗酶液進(jìn)行(NH4)2SO4分級(jí)沉淀，(NH4)2SO4飽和度達(dá)到60%時(shí)，酶比活達(dá)到最大，為633.34 U/mL，相當(dāng)于粗酶液純化倍數(shù)提高了1.17。通過(guò)對(duì)該酶性質(zhì)的研究，可以更加深入的認(rèn)識(shí)愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生，也為愈創(chuàng)木酚的代謝調(diào)控提供參考，以期為基于酶活代謝調(diào)控的控制提供方法和數(shù)據(jù)參考。