盛金鳳，何雪梅，孫健*，零東寧，李麗，李昌寶

1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（南寧 530007）；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧 530007）

金桔（Kumquat），也稱金柑，因具有甜、酸、苦、辣、麻五味，故又名五味果，是一種營養(yǎng)成分豐富的水果。果皮中富含揮發(fā)性精油和類胡蘿卜素，果實(shí)中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、胡蘿卜素、糖、酸、鈣、鎂、鐵、磷等成分[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，金桔還具有較高的藥理活性，對胃病、氣管炎、膽囊炎、肝炎、高血壓、血管硬化等癥狀有一定的輔助治療作用[2-3]，是一種極富開發(fā)前景的水果。但是在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，金桔具有柑橘屬果實(shí)共有的苦味物質(zhì)，成熟的柑橘類果實(shí)鮮食沒有苦味，但經(jīng)放置或加工（如榨汁、發(fā)酵、殺菌等）后會出現(xiàn)強(qiáng)烈的苦味，即柑橘的“后苦味”現(xiàn)象，已成為嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)、制約柑橘類果實(shí)開發(fā)利用的瓶頸問題[4-5]。因此，開展金桔汁脫苦技術(shù)研究，解決金桔汁的制約性苦味問題，對提升金桔汁的品質(zhì)、促進(jìn)金桔的開發(fā)利用具有重大意義。

柑橘類苦味物質(zhì)主要分為兩大類：一類是三萜類化合物，代表物為檸檬苦素、諾米林等；另一類是黃酮類化合物，主要代表物為柚皮苷、新橙皮苷等，以柚皮苷為主[6-9]。果實(shí)種子是合成檸檬苦素類似物最多的部位，只要去除種子，檸檬苦素類似物對金桔苦味影響不大。柚皮苷類主要在果皮中，金桔果實(shí)一般帶皮榨汁，是金桔中“后苦味”形成的主要物質(zhì)[10-12]。脫除類金桔苦味物質(zhì)的方法主要有物理法和生物法。物理脫苦法主要包括吸附脫苦、屏蔽法脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等。生物脫苦法主要包括代謝脫苦、酶法脫苦、固定化細(xì)胞脫苦和基因工程脫苦等[5,13-14]。酶法脫苦具有專一性強(qiáng)、對果汁風(fēng)味和營養(yǎng)成分破壞小、效果好、操作簡單、成本低等特點(diǎn)，是目前較為理想的脫苦方法[5,15]。王鴻飛等[14]開展了柚皮苷酶對胡柚汁脫苦效果的研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了柚皮苷酶的最佳脫苦工藝條件，脫苦率達(dá)85%。曾霖霖[5]利用柚皮苷酶對金桔汁進(jìn)行脫苦，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了脫苦的最佳工藝，脫苦率為48.23%。可見利用柚皮苷酶對金桔汁脫苦的研究較少，且脫苦率（48.23%）未達(dá)到理想值，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝，提高脫苦率。柚皮苷酶的生物活性受到很多條件的限制，要保持酶的最大活性通常需要注意酶用量、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和作用時(shí)間等因素。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法就柚皮苷酶對金桔汁脫苦的工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高金桔汁的脫苦率，同時(shí)考察脫苦對金桔汁營養(yǎng)成分的影響，為金桔汁的酶法脫苦技術(shù)提供技術(shù)依據(jù)，為金桔的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金桔，新鮮果實(shí)，產(chǎn)于廣西陽朔；柚皮苷，Sigma公司；柚皮苷酶，河南領(lǐng)航。

L 400低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；752 N紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；101-3電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海浦東形容科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-82水浴恒溫振蕩器（金壇市恒豐儀器廠）；CU 600型電熱恒溫水箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)有限公司）；UW 4200 S電子天平（日本島津）；PHS-25 pH計(jì)，手持式折光儀。

1.2 金桔汁制備、脫苦工藝流程

原料清洗→榨汁→粗濾→離心過濾（8 000 r/min，10 min）→酶解脫苦→滅酶（95 ℃，5 min）→測定柚皮苷含量和VC含量→計(jì)算脫苦率和VC保留率

1.3 柚皮苷的測定和脫苦率的計(jì)算

采用改進(jìn)的Davis法。

1.3.1 樣品測定

精確吸取0.5 mL金桔汁于25 mL具塞試管中，分別加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后于40 ℃保溫10 min，在432 nm出測吸光度。以0.5 mL樣液，加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL蒸餾水作為試劑空白。所得吸光度根據(jù)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣液中柚皮苷含量。

1.3.2 脫苦率計(jì)算

脫苦效果評價(jià)以金桔汁中柚皮苷脫除率來表示，脫除率的計(jì)算采用式（1）。柚皮苷含量越低，柚皮苷脫除率越高，脫苦效果越好。

式中：D為柚皮苷脫除率，即脫苦率，%；A0為處理前金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL；A1為脫苦處理后金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL。

1.4 柚皮苷酶脫苦單因素試驗(yàn)

以柚皮苷酶脫苦率和VC保留率為考察指標(biāo)，選取柚皮苷酶的用量（0.2～1.0 g/L）、金桔汁pH（2～6）、酶解溫度（30～70 ℃）和酶解時(shí)間（30～150 min）四個(gè)影響因素進(jìn)行研究。

1.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取柚皮苷酶的用量、金桔汁pH、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對柚皮苷酶脫苦工藝進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1，0和1編碼，以金桔汁脫苦率Y為響應(yīng)值，其具體因素與水平列表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.6 柚皮苷酶脫苦處理后金桔汁品質(zhì)的測定

1.6.1 維生素C保留率

VC含量的測定采用GB/T 5009.159—2003《食品中還原型抗壞血酸的測定》中的分光光度法采用測定。VC保留率的計(jì)算采用式（2）。

式中：R為VC保留率，%；C0為處理前金桔汁中VC含量，mg/mL；C1為脫苦處理后金桔汁中VC含量，mg/mL。

1.6.2 可溶性固形物（TSS）含量

采用GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光計(jì)法進(jìn)行測定。

1.6.3 可滴定酸（TAA）含量

總酸含量測定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的pH電位法進(jìn)行測定。

1.6.4 游離氨基酸含量

采用氨基酸全自動分析儀進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 柚皮苷酶用量對脫苦效果的影響

從圖1中可以看出，隨著酶用量的增加，脫苦率呈逐漸增大的趨勢。當(dāng)酶用量為0.2～0.6 g/L時(shí)，脫苦率迅速增大，從54.6%增大至79.2%；當(dāng)酶用量大于0.6 g/L時(shí)，脫苦率呈現(xiàn)緩慢增大的趨勢。柚皮苷酶用量對脫苦效果有較大的影響。用量少，苦味物質(zhì)柚皮苷水解不完全，不能達(dá)到脫苦的目的；用量過多，雖能使得柚皮苷盡可能水解，果汁苦味減輕，但酶蛋白過多會引起的混濁、沉淀等現(xiàn)象，給后續(xù)工藝增加許多麻煩。因此選擇柚皮苷用量為0.5～0.7 g/L。

圖1 柚皮苷酶用量對脫苦率的影響

2.1.2 pH對脫苦效果的影響

如圖2所示，柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率隨pH的增大呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)pH為4.0時(shí)，脫苦率達(dá)到最高。故選擇果汁pH在3～5范圍內(nèi)進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。pH脫苦效果的影響不僅在于柚皮苷酶對柚皮苷的水解作用，而且還影響到果汁本身中所含柚皮苷的穩(wěn)定性。一方面，酶對底物進(jìn)行作用時(shí)有其最適pH范圍，不在最適pH范圍內(nèi)酶本身的活性將受到影響，發(fā)揮不了對底物應(yīng)有的作用，對苦味物質(zhì)的水解作用降低從而影響脫苦率；另一方面，果汁中的柚皮苷對果汁的pH具有不穩(wěn)定性，也會影響到用柚皮苷酶進(jìn)行脫苦時(shí)的效果。

2.1.3 酶解溫度對脫苦效果的影響

酶解溫度在30～50 ℃之間時(shí)，柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率迅速增大；在50 ℃到達(dá)最高點(diǎn)；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，脫苦率開始減??；高于60 ℃時(shí)，脫苦率快速下降（圖3）。說明柚皮苷酶對金桔汁中柚皮苷的酶解最適溫度區(qū)間為50 ℃左右。柚皮苷酶有最適反應(yīng)溫度，溫度過低，激發(fā)不了酶的活力，使酶發(fā)揮不了應(yīng)有的作用，會降低對果汁的脫苦效果；溫度過高，能使酶蛋白變性而失去活力。

圖2 pH對脫苦率的影響

圖3 酶解溫度對脫苦率的影響

2.1.4 酶解時(shí)間對脫苦效果的影響

如圖4所示，脫苦率隨著酶解時(shí)間的延長先增大后減小，在90 min時(shí)達(dá)到最大值，脫苦率達(dá)到77.3%，苦味明顯減輕。酶解時(shí)間在30～90 min時(shí)，底物濃度高，在酶用量一定時(shí)酶解速率高，脫苦率迅速增大。當(dāng)柚皮苷逐漸被轉(zhuǎn)化之后，底物減少，酶解速率下降，同時(shí)酶隨著時(shí)間的延長而部分變性。因此選擇酶解時(shí)間為80～120 min。

圖4 酶解時(shí)間對脫苦率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化金桔汁脫苦工藝

2.2.1 回歸方程的建立

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 7.0.0（Stat-Ease，Inc.，Minnesota，USA）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，具體見表2。

對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3，經(jīng)回歸擬和后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可通過回歸方程來表示：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D+0.35AB+0.20AC+0.28AD-0.19BC+0.098BD+0.74CD-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2（R2=0.948 8）

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表3可知，方程達(dá)極顯著水平，同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著，說明方程對試驗(yàn)的擬合度較好，可用方程為不同脫苦條件下柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)F值可以看出，酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量和酶解pH及各因素的二次項(xiàng)對柚皮苷酶脫苦率的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），而各因素交互作用的影響均不顯著（p＞0.05）。依據(jù)系數(shù)估計(jì)值可知，各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：酶解時(shí)間＞pH＞酶添加量＞酶解溫度。在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，對回歸方程（3）進(jìn)行簡化，得：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2

表3 柚皮苷酶脫苦率的回歸分析結(jié)果

2.2.2 因素間交互作用分析

由表3中回歸分析結(jié)果可知，各因素對脫苦率的影響均達(dá)到顯著性水平（p＜0.01），但各因素間交互作用的影響均未達(dá)到顯著水平（p＞0.05），說明各因素的主效應(yīng)是相互獨(dú)立的。圖1為各因素的三維響應(yīng)面圖形，由各圖形中的等高線形狀來看，等高線均為圓形且較稀疏，說明交互作用不明顯。由圖1（A）中酶添加量和pH的響應(yīng)面圖形可知，pH對脫苦率影響較大，在較低的pH環(huán)境下，脫苦率較小，隨著pH的增大，脫苦率也逐漸增大，在pH 4.2左右時(shí)達(dá)到最大。因此在酶解過程中嚴(yán)格控制溶液的pH十分重要。圖1（B）顯示了酶添加量與酶解溫度的交互作用，兩者對脫苦率的影響均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)酶添加量為0.62 g/L，酶解溫度為55 ℃時(shí)脫苦率達(dá)到最大。圖1（C）為酶添加量與酶解時(shí)間交互作用圖，兩因素對脫苦率的影響并不明顯。圖1（D）顯示，當(dāng)pH與酶解溫度較低時(shí)，脫苦率非常低，隨著兩因素水平的提高，當(dāng)酶解溫度在50 ℃左右，pH為4左右時(shí)，脫苦率達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢。從圖1（E）中可知，酶解時(shí)間對脫苦率的影響較小，而pH對脫苦率的影響大，當(dāng)pH為4.2，酶解時(shí)間為90 min時(shí)，脫苦率達(dá)到最大值。圖1（F）表示酶解溫度與酶解時(shí)間對脫苦率的影響，兩因素的響應(yīng)面圖形與圖E相似，適當(dāng)?shù)拿附鉁囟葘γ摽嗦视绊戄^大，而酶解時(shí)間對脫苦率影響較小。

2.2.3 最佳提取工藝的確定

根據(jù)設(shè)計(jì)模型分析得知，柚皮苷酶脫苦的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶添加量0.58 g/L，pH 4.17，酶解溫度50.84 ℃，酶解時(shí)間92.86 min。在此條件下脫苦率為82.63%。為驗(yàn)證該模型的可靠性，根據(jù)實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為：酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解溫度51 ℃，酶解時(shí)間93 min。在此條件下，實(shí)際脫苦率為81.74%，為模型預(yù)測值的98.9%，說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的柚皮苷酶脫苦工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖5 各因素交互作用對柚皮苷酶脫苦率的影響

2.3 脫苦處理后營養(yǎng)品質(zhì)的變化

表4 脫苦處理后金桔汁營養(yǎng)成分的變化

經(jīng)柚皮苷酶脫苦處理3，7和30 d后，金桔汁各營養(yǎng)指標(biāo)的變化見表4。經(jīng)柚皮苷酶法脫苦后，VC含量有一定下降，與對照相比，脫苦處理3 d后，VC含量下降21.2%，7 d后下降22.4%，30 d后下降25.9%，說明酶法脫苦對VC影響較大，處理3 d內(nèi)迅速下降，3 d后基本穩(wěn)定。比較脫苦前后可溶性固形物、總酸和總氨基酸含量的變化，發(fā)現(xiàn)柚皮苷酶對這三個(gè)指標(biāo)影響不大，30 d后分別下降5%，3%和10.2%?？傮w來說，柚皮苷酶脫苦法對金桔果汁的營養(yǎng)品質(zhì)影響較小，是一種適宜的脫苦方法。

3 討論

苦味是影響金桔產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素之一，加工產(chǎn)品中苦味物質(zhì)含量過多會影響它的風(fēng)味。因此開展金桔脫苦研究，對提升金桔加工產(chǎn)品品質(zhì)有重要意義。脫除柑橘苦味物質(zhì)最常用的方法是吸附法和屏蔽法[16-17]。吸附法采用吸附劑，有選擇地吸附除去柑橘類果汁中的苦味成分，從而達(dá)到脫苦的目的。吸附法的優(yōu)點(diǎn)是脫苦效率高，達(dá)90%以上，處理過程帶入到果汁中的雜質(zhì)少，但處理后的果汁由于pH的上升，會引起了一些化學(xué)反應(yīng)，使產(chǎn)品產(chǎn)生硫化物的氣味，并且對維生素C的吸附量也高達(dá)50%以上，對β-胡蘿卜素的影響較大[14,18]。脫苦后的果汁風(fēng)味與營養(yǎng)品質(zhì)降低。屏蔽法脫苦一般添加β-環(huán)狀糊精（β-CD）。β-CD的主要特征是疏水空洞內(nèi)可嵌人一些分子大小、形狀及性質(zhì)相互匹配的化合物，與苦味物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物（包結(jié)復(fù)合物），可有效增加苦味閾值，降低對苦味的敏感性。該方法簡單方便，不需額外的設(shè)備。檸檬苦素脫除率為86.53%，柚皮苷脫除率為24.17%，VC損失率為4.68%，脫苦效果良好，但β-CD的添加會影響果汁口感[16]。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用柚皮苷酶法脫苦技術(shù)對金桔汁進(jìn)行脫苦處理，經(jīng)脫苦條件優(yōu)化，在酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解溫度51 ℃，酶解時(shí)間93 min的條件下，脫苦率達(dá)到81.74%。經(jīng)柚皮苷酶脫苦處理30 d后的金桔汁，VC含量下降25.9%，其他營養(yǎng)指標(biāo)如可溶性固形物、總酸和總氨基酸含量的變化不大。總體來說，柚皮苷酶脫苦法對金桔果汁是一種適宜的脫苦方法。

柚皮苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。α-L-鼠李糖苷酶可將柚皮苷水解為櫻桃苷和鼠李糖，櫻桃苷的苦味約為柚皮苷的1/3；櫻桃苷可在β-D-葡萄糖苷酶的繼續(xù)作用下生成無苦味的柚皮素和葡萄糖[19]。酶法脫苦具有專一性強(qiáng)、對柑橘果汁風(fēng)味和營養(yǎng)成分無破壞、效果好、成本低等特點(diǎn)[14]，具有其它方法所沒有的高效、快速及高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的脫苦方法，該方法為金桔產(chǎn)品的脫苦處理提供技術(shù)支撐，對提升金桔加工產(chǎn)品品質(zhì)有重要意義。