李慧敏，王新南，王家林，張曉冬，劉全蘭*

1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院（青島 266042）；2. 山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心（濟南 250100）

乳酸是Scheele C. W.于1780年在酸奶中發(fā)現(xiàn)，1881年Fermi發(fā)酵法獲得，直至2012年，全球乳酸產(chǎn)量達到259 000噸 t[1]，現(xiàn)廣泛應(yīng)用到食品、藥品、化妝品、建材及畜牧業(yè)等行業(yè)。乳酸多通過乳酸菌發(fā)酵碳水化合物來生產(chǎn)，乳酸產(chǎn)物的純度會因菌株、碳水化合物成分、發(fā)酵時間的不同而出現(xiàn)變化。最近研究表明乳酸菌在發(fā)酵液中能形成乳酸、乙酸等C2～C5短鏈脂肪酸，它們可在污水處理的碳源供給中發(fā)揮重要作用，Tang等[2]把食品廢水的乳酸發(fā)酵液添加到污水中，可有效去除其中的氮，脫氮率為5.5 mg NOx-N/（g-VSS h）；劉智曉等[3]將污泥發(fā)酵形成的乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、異戊酸等（C2～C5）短鏈脂肪酸逆向應(yīng)用于污泥，不僅有效地提高除磷脫氮效率，還降低了污水廠的污泥產(chǎn)量。因此，乳酸菌發(fā)酵液中的乳酸或乳酸、乙酸等C2～C5短鏈脂肪酸將在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮積極的作用。

甘蔗糖蜜來源于甘蔗的制糖工藝，其主要成分為可發(fā)酵性糖類，約占50%[4]；因其含有豐富的微量元素、維生素、礦物質(zhì)及生長因子等，可為微生物生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。在實際生產(chǎn)中，甘蔗糖蜜可發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、酒精、焦糖色素等[5-6]。試驗選用6株乳酸菌發(fā)酵甘蔗糖蜜來生產(chǎn)乳酸等C2～C5短鏈脂肪酸，并通過發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分配比的調(diào)控、有機酸的定性和定量、甘蔗糖蜜的糖消耗率來分析乳酸菌利用甘蔗糖蜜生產(chǎn)乳酸、乙酸的能力，為甘蔗糖蜜的乳酸發(fā)酵液來生產(chǎn)乳酸或乳酸、乙酸等的C2～C5短鏈脂肪酸提供應(yīng)用數(shù)據(jù)，篩選出高效發(fā)酵甘蔗糖蜜的菌株以用于將來的工業(yè)化應(yīng)用。

1 材料及方法

1.1 材料及儀器試劑

試驗菌株分離篩選于苜蓿、市售牡蠣、市售酸奶，選取溶鈣圈較大的菌株，分別為編號MX1、MX4，ML7、ML11，SN2、SN3，保存于青島科技大學(xué)精細樓基因資源室。

試驗所采用的MRS培養(yǎng)基和葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，見參考文獻[7]，采用的鑒定培養(yǎng)基成分見參考文獻[8]。甘蔗糖蜜，青島磐石糖業(yè)商貿(mào)有限公司。甘蔗糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基的150 g/L碳源為甘蔗糖蜜與葡萄糖按照5個不同質(zhì)量比例（0:1，1:1，2:1，3:1和1:0）配置，其余成分同葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分別編號為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。

試驗所采用的YQX-11型厭氧培養(yǎng)箱及SW-CJ-IF型超凈工作臺購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相Waters Alliance 2695測定儀購自美國沃特世科技有限公司。

1.2 甘蔗糖蜜的發(fā)酵

1.2.1 菌株發(fā)酵類型的鑒定

采用鑒定培養(yǎng)基進行發(fā)酵類型的鑒定，分別將6株乳酸菌接入APT培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基頂端覆蓋1～2 cm厚軟瓊脂柱，形成PY培養(yǎng)基，于恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其變化。若PY培養(yǎng)基中瓊脂柱產(chǎn)生位移則為同型菌株；反之則為異型[8]，注意8 h后重復(fù)觀察。

1.2.2 乳酸菌對甘蔗糖蜜的發(fā)酵

將凍藏在-20 ℃的菌株按5%接種量接種于MRS培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃靜止培養(yǎng)，得到一級種子液，再將上述種子液接入MRS液體培養(yǎng)基中活化，獲得二級種子培養(yǎng)液。將二級種子培養(yǎng)液按10%接種量分別接種于不同成分的5種發(fā)酵培養(yǎng)基（同1.2.1所述），將培養(yǎng)液放置于搖床中培養(yǎng)（120 r/min）；發(fā)酵過程中，間隔8 h添加4 mol/L氫氧化鈉，維持發(fā)酵液的pH保持在5.1～5.4之間。上述步驟均操作于超凈臺中。

1.3 分析方法

1.3.1 甘蔗糖蜜發(fā)酵液中乳酸、乙酸、甲酸的高效液相色譜分析

甘蔗糖蜜發(fā)酵液中乳酸等小分子酸采用高效液相色譜儀進行分析，色譜儀為美國Waters Alliance 2695，檢測器為Waters 2487紫外檢測器，色譜柱為Sino Chrom ODS-BP（150 mm×4.6 mm，10 μm），流動相為5%磷酸氫二銨溶液，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min；樣品經(jīng)0.01 mol/L硫酸酸解稀釋后，再經(jīng)0.22 μm針式過濾器處理后進樣[9-11]。

1.3.2 甘蔗糖蜜轉(zhuǎn)化率的分析

采取3, 5-二硝基水楊酸法測定乳酸細菌對葡萄糖的利用率[12-13]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配成1 mg/mL的母液，再從中分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在540 nm波長下測定吸光度，并繪制吸光度-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品經(jīng)0.01 mol/L硫酸酸解后雙蒸水稀釋，隨后處理方式同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品一致，測定發(fā)酵液中的糖分。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的發(fā)酵類型

同型發(fā)酵菌株對糖分的理論轉(zhuǎn)化率為100%，發(fā)酵產(chǎn)物主要是乳酸；異型發(fā)酵菌株對糖分的理論轉(zhuǎn)化率為50%，產(chǎn)物有乳酸、乙酸、CO2等[8]。培養(yǎng)24 h及重復(fù)觀察8 h后，菌株MX4、SN2、SN3均未產(chǎn)生瓊脂柱位移，判斷為同型發(fā)酵類型；其余3株為異型發(fā)酵類型，存在葡萄糖浪費的現(xiàn)象。

2.2 甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜分析

在高效液相色譜波長為210 nm條件下，測定的Ⅰ號培養(yǎng)基與Ⅴ號培養(yǎng)基發(fā)酵液中出現(xiàn)3種有機酸。甲酸、乳酸、乙酸出峰時間分別為3.827，5.959和6.331 min。以峰面積為縱坐標(biāo)、酸含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)：甲酸，y=563.14x-5 004.5，R2=0.999 9；乳酸，y=429.13x-16 885，R2=0.999 2；乙酸，y=428.88x-5 717.5，R2=0.999 8。標(biāo)準(zhǔn)譜圖及樣品譜圖分別為圖1和圖2。

高效液相色譜分析表明，發(fā)酵液中乳酸、乙酸和甲酸的含量在葡萄糖、甘蔗糖蜜為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基（即Ⅰ號與Ⅴ號培養(yǎng)基）中存在共性和特異性（圖2～5）。乳酸在2種發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量均高于乙酸和甲酸，異型發(fā)酵菌株MX1和同型發(fā)酵菌株SN2在Ⅴ號培養(yǎng)基中乳酸含量最高，分別是145.62和130.48 g/L，但它們在Ⅰ號培養(yǎng)基中含量分別是54.45和46.93 g/L，2種培養(yǎng)基之間又存在顯著差異。乙酸在2種發(fā)酵培養(yǎng)中的含量出現(xiàn)顯著波動，異型發(fā)酵ML11、ML7、MX1菌株在2種培養(yǎng)基中都有乙酸形成，Ⅰ號培養(yǎng)基中，含量沒有明顯差異（1.36，1.57和1.84 g/L），而在Ⅴ號培養(yǎng)基中，差異明顯（17.44，1.68和2.44 g/L）；同型發(fā)酵菌株MX4與SN3僅在Ⅴ號培養(yǎng)基中檢測到乙酸（2.45和1.97 g/L），而SN2菌株在兩種培養(yǎng)基中均未檢測到乙酸。甲酸在兩種發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量最少，無論同型發(fā)酵菌株還是異型發(fā)酵菌株在兩種培養(yǎng)基中含量均低于1.5 g/L。可見，碳源對乳酸菌發(fā)酵液中乳酸、乙酸和甲酸的含量有明顯改變。

酸的測定結(jié)果表明，Ⅰ號培養(yǎng)基中，SN2是同型發(fā)酵菌株中產(chǎn)酸最高的（130.48 g/L的乳酸和0.83 g/L的甲酸），MX1是異型發(fā)酵菌株中產(chǎn)酸最高的（145.62 g/L的乳酸、1.84 g/L的乙酸和0.66 g/L的甲酸）。Ⅴ號培養(yǎng)基中，MX4是同型發(fā)酵菌株中產(chǎn)酸最高的（107.27 g/L的乳酸、2.45 g/L的乙酸和0.02 g/L的甲酸），ML7是異型發(fā)酵菌株中產(chǎn)酸最高的（104.21 g/L的乳酸、1.68 g/L的乙酸和1.07 g/L的甲酸）。試驗中，甘蔗糖蜜濃度為15%（150 g/L），SN2可發(fā)酵形成130.48 g/L的乳酸；黃靖華等[14]用乳酸菌發(fā)酵糖蜜（濃度為20%）可得到106 g/L的乳酸。這進一步說明甘蔗糖蜜可被此次試驗的乳酸菌進行高效發(fā)酵。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（甲酸、乳酸、乙酸）的高效液相圖譜

圖2 樣品（甲酸、乳酸、乙酸）的高效液相圖譜

圖3 Ⅰ號培養(yǎng)基與Ⅴ號培養(yǎng)基中乳酸產(chǎn)物量比較

圖4 Ⅰ號培養(yǎng)基與Ⅴ號培養(yǎng)基中乙酸產(chǎn)物量比較

圖5 Ⅰ號培養(yǎng)基與Ⅴ號培養(yǎng)基中甲酸產(chǎn)物量比較

2.3 乳酸細菌對糖蜜的利用率

DNS法測定原理為3, 5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與還原糖共熱后被還原成棕紅色3-氨基-5-硝基水楊酸[15]，顏色深淺與含量正相關(guān)，所測葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

測定結(jié)果表明，6株乳酸菌均對5種培養(yǎng)基中糖分的消耗率在70%以上，表明它們有高發(fā)酵力（圖7）；Ⅱ號培養(yǎng)基中，菌株對糖分的消耗率在85%左右，說明此時的碳源配比是適應(yīng)乳酸菌發(fā)酵的通用配比；Ⅳ號培養(yǎng)基中，MX1、MX4和SN2對糖分發(fā)酵的消耗率在90%左右，說明此時的碳源配比有利于這3株乳酸菌對糖分的高效轉(zhuǎn)化。Ⅴ號培養(yǎng)基中，同為異型發(fā)酵菌株的ML11與MX1相比，糖分的消耗率高，單產(chǎn)酸量低，這暗示著ML11消耗的糖蜜被轉(zhuǎn)化成較多的CO2；同型發(fā)酵菌株中，SN2糖分消耗率及產(chǎn)酸率雙高，這說明SN2可高效的把甘蔗糖蜜轉(zhuǎn)化為乳酸等發(fā)酵產(chǎn)物。

綜上所述，同型發(fā)酵菌株SN2對甘蔗糖蜜有高的轉(zhuǎn)化率，在Ⅰ號與Ⅴ號培養(yǎng)基中均未檢測到乙酸的形成；而同型發(fā)酵菌株MX4對葡萄糖有高的轉(zhuǎn)化率，在Ⅰ號與Ⅴ號培養(yǎng)基中均檢測到乙酸形成；同型發(fā)酵菌株SN2和MX4在Ⅳ號培養(yǎng)基中，對糖分的利用率均高于Ⅰ號與Ⅴ號發(fā)酵培養(yǎng)基。按照菌株發(fā)酵產(chǎn)物有機酸的特征（圖3～圖5），同型發(fā)酵菌株SN2在Ⅳ號發(fā)酵培養(yǎng)基中有機酸產(chǎn)物推測以乳酸為主，該菌株的發(fā)酵液適合于生產(chǎn)乳酸；同型發(fā)酵菌株MX4在Ⅳ號發(fā)酵培養(yǎng)基中有機酸的主要產(chǎn)物是乳酸，伴有一定量的乙酸和微量的甲酸，這說明菌株MX4的發(fā)酵液適于做為污水處理的C2～C5碳源補給。

圖6 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 乳酸細菌在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中對還原性糖的消耗率

3 結(jié)論與展望

通過使用工業(yè)制糖廢料——甘蔗糖蜜為發(fā)酵原料，并按照不同糖分配比配置5組培養(yǎng)基，利用6株乳酸菌進行發(fā)酵，結(jié)果表明蔗糖糖蜜與葡萄糖為1:1的發(fā)酵培養(yǎng)基為較適的通用配比，甘蔗糖蜜與葡萄糖為3:1的發(fā)酵培養(yǎng)基為特異乳酸菌SN2和MX4發(fā)酵的最佳糖分配比，這說明甘蔗糖蜜的添加對有機酸代謝產(chǎn)物的形成有積極影響；異型發(fā)酵菌株ML7和MX1分別在以葡萄糖和甘蔗糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中優(yōu)勢產(chǎn)酸，達104.21和145.62 g/L；同型發(fā)酵菌株中MX4和SN2分別在以葡萄糖和甘蔗糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中優(yōu)勢產(chǎn)酸，達107.27和130.48 g/L；按菌株發(fā)酵產(chǎn)物的特征推斷得知，同型發(fā)酵菌株SN2在甘蔗糖蜜與葡萄糖的配比為3:1的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物主為乳酸，其發(fā)酵液更適于生產(chǎn)乳酸；同型發(fā)酵菌株MX4在甘蔗糖蜜與葡萄糖的配比為1:3的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物主為乳酸、乙酸及微量甲酸，其發(fā)酵液更適于做污水處理的碳源補給。

試驗探究了甘蔗糖蜜的乳酸菌發(fā)酵液產(chǎn)物，結(jié)果表明菌株SN2的甘蔗糖蜜發(fā)酵液具有生產(chǎn)乳酸的廣闊前景，菌株MX4的甘蔗糖蜜發(fā)酵液可應(yīng)用于污水處理中的碳源補給，這些結(jié)果表明甘蔗糖蜜的乳酸發(fā)酵液可增加甘蔗糖蜜的附加值，實現(xiàn)資源的高效循環(huán)利用，形成“制糖廠→甘蔗糖蜜收集廠→甘蔗糖蜜的乳酸發(fā)酵廠→發(fā)酵液濃縮→乳酸鹽”或“制糖廠→甘蔗糖蜜收集廠→甘蔗糖蜜的乳酸發(fā)酵廠→發(fā)酵液添加到廢水處理廠→潔凈水”等的良好模式，這將為甘蔗發(fā)展提供綠色的生態(tài)循環(huán)模式。