張華丹，張玲云，張國(guó)玉，梁鵬*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（福州 350002）；2. 遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司（大連 116113）

南極磷蝦（Antarctic krill）是一類(lèi)生活在南大洋南極水域的磷蝦，以數(shù)億噸之巨的總量成為了南極大多數(shù)生物的食物來(lái)源[1]。據(jù)估計(jì)，南極磷蝦的可捕撈量每年超過(guò)1 000萬(wàn) t。由于世界人口的增加，糧食的短缺，南極磷蝦很可能成為世界上最后的海洋資源[2]。

南極磷蝦是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水產(chǎn)品，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。南極磷蝦中蛋白含量豐富，必需氨基酸比例合適，是人類(lèi)理想的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食物[3]，作為一種寶貴的富含ω-3脂肪酸和蛋白質(zhì)的可持續(xù)資源，南極磷蝦可加工成供人類(lèi)食用的磷蝦粉[4]。目前，南極磷蝦粉是南極磷蝦資源開(kāi)發(fā)利用的主要產(chǎn)品，將南極磷蝦粉及其水解產(chǎn)物作為原料，應(yīng)用于色素、魚(yú)和蔬菜蛋白質(zhì)、誘食劑等產(chǎn)品中具有很大的市場(chǎng)前景[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)對(duì)南極磷蝦粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及組成成分展開(kāi)了大量的研究。結(jié)果表明南極磷蝦粉中平均蛋白質(zhì)含量達(dá)到60%，且含有豐富的脂肪酸[5]，說(shuō)明南極磷蝦粉具備較大的開(kāi)發(fā)利用前景。

為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用南極磷蝦蛋白粉資源，試驗(yàn)率先通過(guò)酶法水解南極磷蝦粉擬獲得多肽，以期提高其食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外，還可為其水解產(chǎn)物制備成天然魚(yú)醬油、食源肽提供優(yōu)質(zhì)原料，降低生產(chǎn)成本[6]。然而，目前有關(guān)南極磷蝦蛋白粉酶解工藝方面的研究報(bào)道還較鮮見(jiàn)。因此，研究擬在比較中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解效果的基礎(chǔ)上，選擇最優(yōu)酶對(duì)南極磷蝦蛋白粉進(jìn)行酶解，并采用響應(yīng)面法來(lái)獲得酶解南極磷蝦粉的最優(yōu)工藝。研究結(jié)果可為南極磷蝦粉的深加工提供理論依據(jù)，對(duì)拓展南極磷蝦蛋白的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦粉：由遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司饋贈(zèng)；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、甲醛等化學(xué)試劑（AR），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫磁力加熱攪拌器（HJ-4 A），江蘇金壇市宏華儀器廠(chǎng)；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（ST 2100），奧豪斯儀器（常州）有限公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-20 M），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀（K 9840），濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解流程

稱(chēng)取南極磷蝦粉10 g，按以下流程進(jìn)行酶解[7-8]：

南極磷蝦粉樣品→加入磷酸鹽緩沖溶液→調(diào)節(jié)至酶的最適溫度和pH→加入蛋白酶→酶解一定時(shí)間→95℃滅酶15 min→冷卻至室溫→4 ℃下8 000 r/min離心15 min→過(guò)濾→獲得酶解液

1.3.2 水解度（DH）計(jì)算

1) 蛋白質(zhì)水解度是指蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中肽鍵被斷裂的程度，即酶解液中游離氨基酸態(tài)氮總含量與總氮含量的比值[9]，計(jì)算公式如式（1）所示：

2) 總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用國(guó)標(biāo)中凱氏定氮法[10]，計(jì)算公式如式（2）所示：

式中：X1為總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/100 g；V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V3為吸取消化液的體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L。

3) 酶解液游離氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法：參考文獻(xiàn)[9]，并略有改進(jìn)。取離心過(guò)濾后的酶解液10 mL定容于100 mL容量瓶中，吸取10.0 mL稀釋液，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，充分混合搖勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[c（NaOH）=0.050 mol/L]滴定至pH計(jì)指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，再加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)用蒸餾水代替酶解液做空白對(duì)照，記下所消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的體積。計(jì)算公式如式（3）所示：

式中：X2為試樣中游離氨基酸態(tài)氮的含量，g/100 mL；V1為試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為試劑空白加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；V為吸取試樣的體積，mL；V3為試樣稀釋液的取用量，mL；V4為試樣稀釋液的定容體積，mL。

1.3.3 最優(yōu)酶及最適料液比選取

將南極磷蝦粉與磷酸鹽緩沖溶液按一定比例配成樣品溶液后，調(diào)節(jié)至各酶的最適溫度和pH，分別加入酶量為0.4%的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶。酶解結(jié)束后，測(cè)定其酶解液水解度，比較這四種酶的水解效果，確定最優(yōu)酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)表明，最優(yōu)酶為堿性蛋白酶。因此在后續(xù)研究過(guò)程中采用堿性蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)。堿性蛋白酶最適pH值為8.0，最適酶解溫度為50 ℃，在最適pH和溫度下，添加0.4%的酶，酶解時(shí)間4 h，此條件下，以料液比1:10，1:20，1:30，1:40和1:50（g/mL）進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1:30（g/mL）時(shí)酶解液水解度最高，因此以料液比為1:30（g/mL）開(kāi)展單因素試驗(yàn)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

初始pH的選擇：采用不同pH的磷酸鹽緩沖溶液，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至酶解初始pH分別為7.5，8，8.5，9和9.5，酶添加量為0.4%，50 ℃下酶解4 h后滅酶離心過(guò)濾得酶解液，測(cè)定其水解度，確定最佳酶解初始pH。酶解溫度的選擇：在酶解溫度分別為40，45，50，55和60 ℃時(shí)，酶添加量為0.4%，在最佳pH條件下酶解4 h測(cè)定其酶解液的水解度，以確定最佳的酶解溫度。酶添加量的選擇：測(cè)定酶添加量分別為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%，于最佳酶解pH和溫度時(shí)酶解4 h條件下測(cè)定其酶解液水解度，確定最佳的酶添加量。酶解時(shí)間的選擇：在最佳酶解pH、溫度和酶添加量時(shí)，測(cè)定酶解時(shí)間分別為2，3，4，5和6 h的酶解液水解度，確定最佳酶解時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)值，開(kāi)展四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以確定南極磷蝦蛋白粉酶解的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶及最適料液比的選擇

具有不同構(gòu)象的蛋白酶，針對(duì)同種底物其作用位點(diǎn)不同，產(chǎn)生一定差異的功能特性因而具有不同的反應(yīng)活力[11]。從圖1中可以看出，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶這四種酶酶解南極磷蝦蛋白的水解效果差異明顯。其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶在四種蛋白酶中水解度較低，胰蛋白酶水解度較高，而堿性蛋白酶的水解效果最好，水解度達(dá)到12.19%。因此確定堿性蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。在堿性蛋白酶最適酶解溫度50 ℃，酶解pH為8.0時(shí)，酶添加量為0.4%，酶解4 h進(jìn)行最適料液比的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖2，從中可以看出，在料液比為1:30（g/mL）時(shí)其水解效果最好，水解度達(dá)到11.60%。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，酶與底物不能很好地結(jié)合，水解度隨著濃度的降低而不斷降低；在高濃度時(shí)，底物的流動(dòng)性變差，酶跟底物不能充分接觸，且加水量少造成其低水分活度，抑制了推動(dòng)其反應(yīng)所需的自由能，導(dǎo)致水解度下降[12]，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，確定料液比為1:30（g/mL）進(jìn)行后續(xù)的單因素試驗(yàn)

圖1 幾種酶對(duì)南極磷蝦蛋白粉的水解效果

圖2 料液比對(duì)南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖3可以看出，隨著酶解體系pH的升高，水解度也隨之增大，當(dāng)pH為8時(shí)，水解度達(dá)到最大，隨著pH的繼續(xù)增大，水解度開(kāi)始下降。堿性蛋白酶的最適pH為8，低于或者高于這一pH條件時(shí)，其蛋白酶活力會(huì)下降導(dǎo)致酶解能力減弱水解度降低。

圖3 pH對(duì)南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖4可以看出，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在溫度為45 ℃時(shí)水解效果最好，水解度達(dá)到13.45%。這是由于隨著溫度的升高，酶活力也在逐漸變大，酶促反應(yīng)加快，但當(dāng)超過(guò)最適溫度，酶活力開(kāi)始變小。因此試驗(yàn)采取45 ℃左右為酶解的最適溫度。

圖4 溫度對(duì)南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖5可以看出，在酶添加量為0.4%～1.2%時(shí)，水解度增加趨勢(shì)平緩；在酶添加量為1.2%～1.6%時(shí)水解度顯著增加；在酶添加量為1.6%～2.0%時(shí)，水解度幾乎保持不變，這是由于底物逐漸被消耗，酶趨于飽和狀態(tài)，綜合水解效果和工藝成本的考慮，選取酶添加量為1.6%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 酶添加量對(duì)南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖6可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度不斷增加，但當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)5 h以后，水解度開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力下降部分酶的失活，而且過(guò)度水解導(dǎo)致氨基酸被破環(huán)，游離氨基氮含量減少?gòu)亩鴮?dǎo)致水解度降低[13]。因此確定酶解時(shí)間為5 h比較適宜。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

2.2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，取pH、酶添加量、溫度和時(shí)間為影響因素，以水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平設(shè)置見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2的結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程：DH=+15.06+0.34A+0.71B+0.34C-0.086D-0.10AB-0.065AC+0.20AD-0.15BC+0.60BD-0.32CD-1.14A2-0.82B2-0.59C2-0.51D2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)所建立的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3方差分析可知，模型極顯著（p=0.009 5＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.098 2＞0.05），試驗(yàn)無(wú)失擬因素存在，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合程度好。變異系數(shù)C.V.=4.76%，變異系數(shù)較低，說(shuō)明試驗(yàn)的可信度與精密度較高，此次試驗(yàn)精密度為6.571＞4，在精密度試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性撃Ｐ途芏攘己?。在此試?yàn)設(shè)計(jì)中，B、A2、B2項(xiàng)均為極顯著（p＜0.01），C2項(xiàng)影響顯著。由表3中F值可以看出，各因素對(duì)南極磷蝦蛋白酶解液水解度的影響程度依次是：酶解時(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度＞初始pH。交互項(xiàng)對(duì)酶解效果影響不是很突出。

表3 二次回歸模型及方差分析

各因素之間的交互作用響應(yīng)面圖如圖7～圖12。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各因素之間所構(gòu)成的三維圖，因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小決定了曲線(xiàn)的陡峭程度[14]。由圖7，圖9和圖11可以看出，溫度和時(shí)間、溫度和pH、pH和時(shí)間這三組的兩兩交互作用對(duì)水解效果影響較顯著。由圖8和圖12可以看出，在較低的溫度和較低pH的情況下，堿性蛋白酶的活性較低，通過(guò)酶量的增加可以提高酶的水解能力，這與單因素的試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖8 溫度和酶添加量交互作用對(duì)水解度的影響

圖9 溫度和pH交互作用對(duì)水解度的影響

圖10 酶添加量和時(shí)間交互作用對(duì)水解度的影響

圖11 pH和時(shí)間交互作用對(duì)水解度的影響

圖12 酶添加量和pH交互作用對(duì)水解度的影響

2.3 最佳酶解方案驗(yàn)證

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝，經(jīng)曲面擬合后，得到的最佳酶解條件為：酶解溫度為45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解時(shí)間5.47 h、pH為8.08。在此條件下預(yù)測(cè)的水解度達(dá)到15.27%。為了檢測(cè)模型預(yù)測(cè)的可靠性，驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程中采取酶解溫度46 ℃、酶添加量1.7%、酶解時(shí)間5.5 h、初始pH為8.08，進(jìn)行三次預(yù)測(cè)試驗(yàn)，測(cè)得的水解度平均值為15.41%與理論值預(yù)測(cè)值15.27%誤差較小，說(shuō)明該響應(yīng)面模型可靠。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化南極磷蝦蛋白的酶解工藝，采用了Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理與響應(yīng)面分析，建立了酶解工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。通過(guò)對(duì)模型的響應(yīng)面分析，了解各因素及其交互作用對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響[15]。其中時(shí)間是影響南極磷蝦粉酶解的關(guān)鍵因素。從響應(yīng)曲面圖可以看出來(lái)，溫度和時(shí)間、溫度和pH、pH和時(shí)間，這三組交互作用明顯，其他因素之間的交互作用不太明顯。最后，對(duì)二次模型的分析獲得了酶解南極磷蝦蛋白的最佳工藝條件，即酶解溫度為45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解時(shí)間5.47 h、pH為8.08，在此條件下，水解度可達(dá)15.27%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)可知，該模型能很好地預(yù)測(cè)南極磷蝦蛋白的水解度。