王曉玲*，張玉清，賀延蘢，韋素貞，付硯渤，張雨晴

威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系（榮成 264300）

帶魚（Hairtail）是我國盛產(chǎn)的四大經(jīng)濟魚種之一，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布。在帶魚加工過程中產(chǎn)生的下腳料占帶魚質(zhì)量的1/2以上[1-2]，這些下腳料中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，若隨意丟棄不僅浪費資源，還會污染環(huán)境，故有效利用帶魚下腳料便成為研究熱點。

蛋白肽金屬螯合物是多肽、小肽或氨基酸與金屬離子以配位鍵結(jié)合而成，具有營養(yǎng)高、吸收快及多種生物活性等優(yōu)點。目前關(guān)于金屬螯合物的文獻(xiàn)，主要集中于金屬螯合物抑菌、抗氧化、降血脂、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等活性研究。Sarah等[3]研究發(fā)現(xiàn)GHTD氨基化合物及其類似物ISF402與鋅配合后與胰島素并用，與單獨使用胰島素相比，可顯著降低患糖尿病小鼠體內(nèi)血糖。Ambar等[4]研究發(fā)現(xiàn)Humanin肽對β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的神經(jīng)毒素有抑制作用，是因為該肽分子中螯合有鋅離子，形成八面體的配合物。

試驗以帶魚下角料為原料，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解得帶魚蛋白水解肽，并與氯化亞鐵、氯化鎂、氯化鋅、氯化鈣螯合，制得4種對應(yīng)帶魚蛋白水解肽-金屬配合物，即鐵肽、鎂肽、鋅肽、鈣肽。研究水解條件及螯合條件對配合物的影響，為優(yōu)化帶魚蛋白水解肽-金屬配合物的制備條件，并為后期研究帶魚蛋白水解肽-金屬配合物脫除重金屬活性研究準(zhǔn)備，以期發(fā)明一種高效、經(jīng)濟、環(huán)保脫出重金屬的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶魚下腳料，市售，將帶魚經(jīng)碎肉粉碎機粉碎后，分裝成100 g/袋，于-18 ℃冰箱冷凍保存，使用前于4 ℃冰箱解凍24 h。

1 000 mg/L鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；1 000 U/mg木瓜蛋白酶，上海金穗生物科技有限公司；鹽酸羥胺，分析純，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；溴酚藍(lán)，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、氯化鎂（MgCl2· 6H2O）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化鈣（CaCl2）、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、抗壞血酸、乙酸鈉及三氯甲烷（CHCl3），分析純（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗過程中所使用的水皆為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CR 21 G型冷凍離心機，日本日立公司；WTM-1812 G型卷式膜分離設(shè)備，杭州沃騰膜工程有限公司；冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；EYEL 4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 帶魚蛋白水解肽的制備

取20 g解凍好的帶魚下腳料，加入200 mL去離子水，勻漿后調(diào)節(jié)pH為6.5，在45 ℃下保溫10 min。按帶魚下腳料質(zhì)量加入適量的木瓜蛋白酶，在一定溫度下進(jìn)行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并且每隔2 h調(diào)節(jié)pH。酶解結(jié)束后，于90 ℃水浴滅酶10 min，混合液在4 ℃下以5 000 r/min離心20 min，除去上層油膜和下層沉淀即為帶魚蛋白水解肽。酶解條件由試驗探究優(yōu)化得出，料液比1:10 g/mL、加酶量20 000 U/g帶魚、45℃、pH 6.5、酶解6 h，帶魚蛋白水解度高達(dá)71.3%。

1.4 蛋白水解肽-金屬元素配合物的制備

將上述帶魚蛋白水解肽調(diào)pH為7.0，按體積的2%加入1 mol/L氯化亞鐵（加入少量VC作保護(hù)劑）、氯化鎂、氯化鋅、氯化鈣，于30 ℃水浴振蕩合成30 min，以10 000 r/min離心20 min，除去上層油膜和下層沉淀，所得上清液即為蛋白水解肽-金屬元素配合物，簡稱鐵肽、鎂肽、鋅肽、鈣肽（PH-Fe2+、PH-Mg2+、PH-Zn2+、PH-Ca2+）。螯合條件由試驗探究優(yōu)化得出。

1.5 蛋白水解肽-金屬元素配合物的膜分級

在0.35 MPa壓力下，用透過分子量為3 kDa的超濾膜超濾，得到4種分子量小于3 kDa的帶魚蛋白-金屬配合物濾出液，將未螯合帶魚蛋白酶解液、4種金屬元素螯合的酶解液原液及分級的螯合肽段透過液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍、干燥后備用。

1.6 金屬元素螯合率的測定

亞鐵螯合率=（亞鐵離子總量-游離亞鐵離子含量）/亞鐵離子總量×100%，式中游離亞鐵離子含量測定采用鄰二氮菲法[5-6]測定。

鈣螯合率=螯合鈣含量/鈣離子總量×100%，式中螯合鈣含量的測定采用EDTA法[7-8]測定。

鋅螯合率=螯合鋅含量/鋅離子總量×100%，式中螯合鋅含量的測定采用EDTA法[9-10]測定。

鎂螯合率=螯合鎂含量/鋅離子總量×100%，式中螯合鎂含量的測定采用EDTA法[11]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 螯合溫度對蛋白水解肽-金屬配合物制備的影響

鰲合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，因而螯合溫度對水解肽-金屬元素配合物螯合率有一定的影響，溫度越高對反應(yīng)越有利。若溫度太低，則鰲合速度慢且收率低；若溫度太高，容易破壞氨基酸及其鰲合物結(jié)構(gòu)[12]。酶解液分別添加2%的1 mol/L氯化亞鐵（加入少量VC作保護(hù)劑）、氯化鋅、氯化鈣、氯化鎂，在pH 7.0條件下水浴恒溫振蕩60 min后，測定不同溫度對螯合率的影響情況。如圖1所示，4種金屬螯合率隨溫度的升高先增加后降低，在30 ℃左右達(dá)到最大值；在此條件下，鐵肽、鋅肽、鈣肽和鎂肽的螯合率分別為67.7%，64.6%，55.4%和46.8%（p＜0.05）。

2.2 螯合pH對蛋白水解肽-金屬配合物制備的影響

溶液體系pH不同，鰲合反應(yīng)完成的速度和效果也不同。在酸性條件下，溶液中的H+將與金屬離子（亞鐵離子、鎂離子、鋅離子、鈣離子）競爭氨基酸提供的供電子基團而使螯合率降低；而在堿性條件下，金屬離子（亞鐵離子、鎂離子、鋅離子、鈣離子）則會發(fā)生水解，以沉淀析出而使螯合率降低。酶解液分別添加2%的1 mol/L的氯化亞鐵（加入少量VC作保護(hù)劑）、氯化鋅、氯化鈣、氯化鎂，于30 ℃水浴恒溫振蕩60 min，測定不同pH對螯合率的影響。如圖2所示，4種金屬螯合率隨pH的升高先增加后降低，在pH 7.0時達(dá)到最大值，此時鐵肽、鋅肽、鈣肽和鎂肽的螯合率分別為66.9%，62.5%，58.7%和41.2%（p＜0.05）。

圖2 pH對螯合率的影響

2.3 螯合時間對蛋白水解肽-金屬配合物制備的影響

螯合時間對水解肽-金屬元素配合物螯合率也有一定的影響，將酶解液調(diào)節(jié)pH 7.0，分別添加2%的1 mol/L的氯化亞鐵（加入少量VC作保護(hù)劑）、氯化鋅、氯化鈣、氯化鎂，于30 ℃水浴恒溫振蕩10，20，30，40和50 min，測定不同螯合時間對螯合率的影響。螯合時間對水解肽-金屬元素配合物螯合率的影響，如圖3所示。螯合率隨螯合時間延長不斷增大，當(dāng)螯合時間為30 min左右時，4種金屬配合物螯合率達(dá)到最大，最大螯合率分別為鐵肽66.1%，鋅肽64.6%，鈣肽50.4%和鎂肽43.2%；螯合時間繼續(xù)增加，4種金屬螯合率均不再增大（p＞0.05）。

2.4 蛋白水解肽-金屬元素配合物制備條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步驗證上述單因素試驗的準(zhǔn)確性，探究溫度、pH及時間對4種水解肽-金屬元素配合物螯合率影響程度大小，以螯合溫度、螯合pH、螯合時間為影響因素，正交試驗見表1和表2，其試驗結(jié)果見表3。由表2可知，4種水解肽-金屬元素配合物在相同試驗條件下的螯合率各不相同，但它們的變化趨勢是相同的。螯合率隨溫度和pH升高先增大后減小，均在30 ℃、pH 7.0達(dá)到最大螯合率；螯合率隨螯合時間延長，開始時逐漸增大，然后在30 min左右達(dá)到平衡。4種水解肽-金屬元素配合物均是在組合為A2B2C2的6號試驗，即溫度為30 ℃、pH為7.0、時間為30 min，具有最大螯合率，鐵肽、鋅肽、鈣肽和鎂肽螯合率分別為68.9%，65.7%，63.2%和42.3%。

圖3 時間對螯合率的影響

表1 因素與水平

進(jìn)一步由方差分析（表3）可知，溫度、pH和時間對4種水解肽-金屬元素配合物螯合率的影響程度是不同的。鐵肽和鈣肽螯合率受pH影響最大，溫度次之，受時間影響最?。坏}肽受pH、溫度、時間影響程度的差別不大，而鐵肽受pH、溫度、時間影響程度的差別較大（p＜0.05）。鋅肽螯合率受pH影響最大，時間次之，受溫度影響最小；pH的影響程度較顯著，時間和溫度影響程度的差別不顯著（p＞0.05）。鎂肽受時間影響最大，溫度次之，受pH影響最小，但三者影響程度的差別不顯著（p＞0.05）。

3 結(jié)論

試驗探究木瓜蛋白酶酶解帶魚蛋白制得帶魚蛋白水解肽-金屬配合物（鐵肽、鈣肽、鎂肽和鋅肽）最佳螯合工藝條件，得出以下試驗結(jié)論：當(dāng)金屬元素添加量為2%時，帶魚蛋白水解肽-金屬配合物（鐵肽、鈣肽、鎂肽和鋅肽）最佳螯合工藝條件為螯合時間30 min、pH 7.0、溫度30 ℃，鐵肽、鈣肽、鎂肽和鋅肽最大螯合率分別為68.9%，63.2%，65.7%和42.3%。影響鐵肽和鈣肽螯合率的因素為：pH＞溫度＞時間。影響鋅肽肽螯合率的因素為：pH＞時間＞溫度。影響鎂肽螯合率的因素為：時間＞溫度＞pH。