郭宇婷，劉帥民，宋漢良，潘永貴*

海南大學(xué)食品學(xué)院（?？?570228）

檳榔（Betel catechu L.）為中國四大南藥之首，同時也是世界三大口腔嗜物之一，國內(nèi)主產(chǎn)地在海南。雖然，目前市場上檳榔干果可以非常方便地購買，但是仍有許多消費者更喜歡吃檳榔鮮果，再加上有大量的檳榔加工產(chǎn)業(yè)，也需要檳榔鮮果原料，但每年4-7月處于檳榔鮮果空檔期[1-3]。因此，檳榔保鮮技術(shù)研究越來越受到重視。李喜宏等[4]發(fā)現(xiàn)檳榔易受低溫冷害影響從而引起檳榔果仁褐變，但檳榔果仁采后在常溫貯藏過程中也存在果仁褐變問題，直接影響到產(chǎn)品品質(zhì)。目前關(guān)于檳榔褐變只有蔣躍民等[5]曾對檳榔果肉進(jìn)行研究，表明檳榔褐變是由褐變底物綠原酸與多巴胺、部分純化的多酚氧化酶相互作用引起的。然而關(guān)于不同溫度檳榔果仁褐變程度及影響褐變的因素卻鮮有報道。研究表明酶促褐變是果蔬采后生理褐變的主要原因，對于酶促褐變的發(fā)生，是由酚類底物與褐變相關(guān)酶反應(yīng)引起的[6-8]。因此，研究在冷害溫度（5 ℃）、最佳溫度（10 ℃）、中間溫度（15 ℃）和室溫（25 ℃）4種貯藏溫度對檳榔果仁褐變和酶促褐變相關(guān)的酶（PPO，POD和PAL）活性、酚類物質(zhì)的影響。主要目的是評估在4種不同溫度貯藏條件下檳榔果仁褐變程度，以及褐變相關(guān)酶、酚類物質(zhì)變化與褐變之間的關(guān)系，旨在闡明不同溫度下導(dǎo)致褐變的主要影響因素，從而為揭示檳榔果仁褐變機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步控制檳榔果仁褐變提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

無機(jī)械損傷及病蟲害的新鮮檳榔，購于海南省?？谑泄吲l(fā)市場。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二酚、硼酸、雙氧水、愈創(chuàng)木酚、聚乙二醇、L-苯丙氨酸、福林試劑、碳酸鈉等（均為分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CAHT-50 L超純水器（北京中科智恒科技有限公司）；TGL-16 M高速冷凍離心機(jī)（上海盧相儀離心機(jī)儀器有限公司）；T 6系列紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DK-8 D金壇市科興儀器廠；SHZ-Ш循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；V 9648高通量組織研磨儀（鼎昊源科技）；MYP 11-2 A磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）。

1.2 酶促褐變相關(guān)酶測定方法

1.2.1 PPO活性測定

將2 g檳榔果仁和5 mL PBS緩沖液（pH 5.8）于冰浴研磨成勻漿。勻漿在4 ℃、以12 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。將0.5 mL酶液與1.5 mL 0.05 mol/L、pH 7.0的PBS和1.0 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚溶液混合，空白加0.5 mL PBS。反應(yīng)30 s后，在420 nm下測吸光度；之后每隔1 min 測定1次。每分鐘吸光度改變0.001作為1個單位酶活（U）。

1.2.2 POD活性測定

將2 g檳榔果仁和5 mL磷酸緩沖液（pH 6.8）于冰浴中研磨成勻漿。勻漿在4 ℃、以12 000 r/min離心20 min，取上清液，低溫保存?zhèn)溆?。?.2 mL酶液與1.8 mL 0.05 mol/L PBS（pH 6.8）、1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液混合，空白加0.2 mL PBS，加入1 mL 2%的H2O2溶液啟動反應(yīng)。在反應(yīng)開始30 s后記錄470 nm處的吸光度，每隔1 min測定1次，以每分鐘吸光度減少0.001為1個單位酶活（U）。

1.2.3 PAL活性測定

預(yù)冷研缽中加入2 g檳榔果仁，加入預(yù)冷（4 ℃）的0.05 mol/L硼酸緩沖液5 mL（pH 8.0）研磨成勻漿。勻漿在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min，上清液為粗酶液，冷藏備用。將0.5 mL酶液、3.5 mL PBS（pH 8.8）和1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸的混合液在40 ℃下反應(yīng)60 min，空白只加0.5 mL PBS，測定290 nm下的吸光度。

1.2.4 總酚含量測定

加入5 mL預(yù)先冷卻的95%的乙醇與1 g冷凍檳榔果仁混合研磨成勻漿。勻漿在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min，之后稀釋10倍。取0.1 mL待測液和1.9 mL蒸餾水于離心管中，再加入2 mL福林試劑，搖勻，3 min后加入2 mL 10%碳酸鈉振蕩。靜置1 h后700 nm處比色，空白用蒸餾水代替酶液，總酚含量以mg/g兒茶酚表示。

1.2.5 冷害指數(shù)測定方法

試驗中，檳榔冷害分級：冷害面積0定為0級；冷害面積在0～25%定為1級；冷害面積在25%～50%定為2級；冷害面積在50%～75%定為3級；冷害面積在75%～100%定為4級。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度貯藏對褐變相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖1所示，檳榔果仁褐變指數(shù)在貯藏期間呈上升趨勢。其中褐變指數(shù)大小依次為：25 ℃＞5 ℃＞15℃＞10 ℃。常溫25 ℃下檳榔果仁褐變最嚴(yán)重，其次5 ℃溫度引起嚴(yán)重冷害，隨著冷害程度的加重，內(nèi)部褐變也越來越嚴(yán)重，雖然其褐變程度低于常溫下的果實，但顯著地高于10和15 ℃ 貯藏下的檳榔果實。

圖1 不同溫度下貯藏對檳榔果仁褐變指數(shù)的影響

5 ℃下貯藏檳榔果仁冷害指數(shù)變化如圖2所示。不同溫度下貯藏20 d后檳榔果仁褐變癥狀如圖3所示。

圖2 5 ℃下貯藏檳榔果仁冷害指數(shù)變化

圖3 在不同溫度下貯藏20 d后檳榔果仁褐變癥狀

2.2 不同溫度下貯藏對果仁PPO和POD的影響

多酚氧化酶（PPO）是一種能催化多酚類物質(zhì)氧化成褐色的醌類物質(zhì)的含銅金屬酶類，PPO催化分為2個反應(yīng)：一元酚羥基化為二元酚，其反應(yīng)相對較慢并產(chǎn)生無色產(chǎn)物；雙酚到醌的氧化迅速并產(chǎn)生有色產(chǎn)物[12]。從圖4可以看出，檳榔果仁PPO活性在5，10和15 ℃隨著貯藏時間的延長整體呈上升趨勢，而25℃PPO活性0～10 d急劇上升，10～15 d增速放緩，貯藏末期出現(xiàn)下降趨勢，但25 ℃ PPO活性一直顯著高于其他組（p＜0.05）。在5 ℃冷害溫度下PPO活性在0～5 d略低于10 ℃的PPO酶活，但在第10天后超過10和15℃的PPO活性，到20 d時其酶活性分別是15和10 ℃的1.28和1.75倍，PPO活性驟然升高可能是低溫冷害引起細(xì)胞膜遭到破壞，與類囊體膜結(jié)合在一起的PPO被活化，游離的PPO釋放導(dǎo)致其活性較高，而10 ℃的PPO活性受到抑制一直維持在相對較低水平，從而延緩褐變，整體PPO活性為：25 ℃＞5 ℃＞15 ℃＞10 ℃。

POD酶將酚類物質(zhì)氧化成醌類，在H2O2存在下縮合形成褐變聚合物[13]。由圖5可以看出，POD活性整體相對處于較低的活性狀態(tài)。在貯藏初期（0～5 d）所有處理組的POD活性迅速上升，其中5 ℃的增幅最大，顯著高于其他處理組（p＜0.05），隨后各組活性下降，其中25 ℃褐變最嚴(yán)重，但POD活性較低且變化不顯著，不同溫度下POD活性與褐變程度無顯著相關(guān)性，表明在誘導(dǎo)檳榔果仁內(nèi)部褐變期間POD可能不是褐變過程內(nèi)部的關(guān)鍵酶，這與菠蘿和桃果實研究相一致[14-16]。但貯藏初期溫度越低POD活性反而越高，可能是驟然的溫度差導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，游離的POD釋放，導(dǎo)致其活性在前5 d有一個驟然的上升。

2.1.3 不同溫度下貯藏對果仁PAL和總酚含量的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）參與苯丙氨酸的分解過程，其活性的增加會加速酚類物質(zhì)的合成[17]。從圖6可以看出，在整個貯藏期間不同溫度的PAL活性均呈先下降后上升又上升的趨勢，整個貯藏期間25 ℃的PAL活性最高，而10 ℃的PAL活性維持在相對低的水平；5 ℃在第5天之后冷害加重，導(dǎo)致PAL活性迅速上升超過10和15 ℃，達(dá)到峰值時其活性分別是15和10℃貯藏的高出6.9%和26.2%。貯藏前5 d，PAL活性呈下降的趨勢，這與生姜和菠蘿中的研究結(jié)果一致[14,18]，這可能是檳榔對于酚類物質(zhì)消耗還未作出應(yīng)激反應(yīng)。貯藏后期PAL變化趨勢復(fù)雜，可能是檳榔果仁內(nèi)部進(jìn)行著酚類物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化過程，會產(chǎn)生酚類物質(zhì)等且積累量也各不相同，從而導(dǎo)致PAL活性變化復(fù)雜。但整體PAL活性為：25 ℃＞5 ℃＞15 ℃＞10 ℃，褐變越嚴(yán)重PAL活性越高。

酚類物質(zhì)易在多酚氧化酶的作用下被氧化產(chǎn)生褐色物質(zhì)，造成植物組織褐變。如圖7所示，各組檳榔果仁的總酚含量在貯藏期間呈下降趨勢，且25 ℃下降速度快。相對貯藏初期，10 ℃檳榔果仁總酚含量僅下降56.3%，而在15，5和25 ℃分別下降66.5%，71.3%和80%。整體上，在10～25 ℃正常溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，總酚含量也下降越快；而5 ℃冷害溫度下總酚含量下降速度超過10和15 ℃。

圖4 不同溫度下貯藏對檳榔果仁褐變PPO活性的影響

圖5 不同溫度下貯藏對檳榔果仁褐變POD活性的影響

圖7 不同溫度下貯藏對檳榔果仁褐變總酚含量的影響

3 結(jié)論

分析可知，貯藏溫度顯著影響著檳榔果仁褐變程度，在5，10，15和25 ℃貯藏期間發(fā)生檳榔果仁褐變問題，常溫25 ℃下貯藏褐變最嚴(yán)重，5 ℃冷害溫度下檳榔果仁褐變指數(shù)高于10和15 ℃，說明冷害加重檳榔果仁褐變。而10 ℃貯藏褐變最輕，通過抑制PPO、PAL活性從而延緩褐變，降低檳榔果仁褐變的效果最優(yōu)。不同溫度貯藏下褐變程度越高，PPO、PAL活性越高，總酚含量下降也越多，表明PPO、PAL對檳榔果仁中的酶促褐變起重要作用。然而與PPO相比，在整個采后貯藏期間不同溫度下檳榔果仁中存在較低的POD活性且與褐變指數(shù)無顯著相關(guān)性，表明POD不是引起褐變的關(guān)鍵酶。