王凡，葛蒙蒙，高忠輝，王振宇，苗敬芝, *，董玉瑋,

1. 徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院（徐州 221018）；2. 徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室（徐州 221018）

靈芝是一種營養(yǎng)價值和藥用價值極高且無毒副作用的藥食同源真菌[1]，具有扶正固本、滋補強壯的功效，靈芝的主要有效成分有靈芝多糖、三萜類、多肽、生物堿和有機鍺等，具有提高機體免疫力、降血糖血脂、抗腫瘤和延緩衰老等功效[2]。

杏鮑菇是一種藥食兩用的食用菌，杏鮑菇具有降血脂、降膽固醇和促消化等食療效果，杏鮑菇中所含的真菌多糖含有很多的生物活性，能清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。

牛蒡?qū)倬湛婆］驅(qū)?，為藥食同源植物，牛蒡中含有菊糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、鈣、磷和鐵等人體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有清除體內(nèi)毒素、改善體循環(huán)、治療糖尿病、預(yù)防肥胖和便秘等效果明顯[4-5]。

白果中含有銀杏內(nèi)酯、氨基酸和銀杏黃酮等活性成分，具有抗衰老、抗腫瘤和降血糖等功效，同時還具有抑菌作用，對葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌和傷寒桿菌等具有不同程度的抑菌作用[6-7]。

綠茶是采取茶樹上鮮嫩的葉和芽，經(jīng)去青、炒制、烘干，不用發(fā)酵，更好地保留了新鮮茶葉的自然成分，綠茶的主要成分有茶多酚、兒茶素、咖啡堿、氨基酸和維生素等，具有防癌、抗癌、清心和提神等功效[8-9]。

隨著人們生活水平的提高，消費者對飲料的嗜好和需求發(fā)生了巨大變化，向著營養(yǎng)、功能、安全方向發(fā)展。目前對靈芝、杏鮑菇的營養(yǎng)保健作用已得到普遍認(rèn)同，若能將靈芝、杏鮑菇二者放在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行發(fā)酵，研制成新型保健飲料，則營養(yǎng)、功效更為全面，口感更佳，符合消費者對健康的需要，順應(yīng)靈芝、杏鮑菇深加工的發(fā)展趨勢。

試驗采用混合發(fā)酵技術(shù)[10]，選取藥食同源靈芝、杏鮑菇混合發(fā)酵，以牛蒡為培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵液與菌絲體經(jīng)預(yù)處理，與白果汁、菊花汁和綠茶汁等制成涼茶飲料，滿足消費者對保健涼茶飲料的需求，具有良好的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝、杏鮑菇菌種（北京吉蕈園科技有限公司）；白果、牛蒡、土豆、綠茶和蜂蜜等原材料（市場購買）。

酵母浸膏；β-環(huán)狀糊精、海藻酸鈉、硫酸、苯酚、香草醛、高氯酸等試劑（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2 FD超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)配廠）；HH.B 11.600-S-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療機械廠）；HZ 150 L恒溫培養(yǎng)搖床（武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）；DL-5低速大容量離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；IXQSG 46-280 A立式壓力蒸汽滅菌機（上海申安醫(yī)療機械廠）。

1.3 方法

1.3.1 靈芝、杏鮑菇菌種的活化與培養(yǎng)

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照GB 4789.15—2010配制，用于菌種的復(fù)蘇與保存。

制備牛蒡液體培養(yǎng)基：取一定量新鮮去皮牛蒡根，加一定量水，用組織搗碎機破碎，加入定量酵母浸膏混勻，于電爐上煮沸并且保持沸騰幾分鐘。

靈芝、杏鮑菇單菌發(fā)酵培養(yǎng)：取靈芝和杏鮑菇菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化，取活化后靈芝菌塊接種于27 ℃牛蒡液體培養(yǎng)基中，在110 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)7 d，取活化后杏鮑菇菌塊接種于25 ℃牛蒡液體培養(yǎng)基中，120 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5 d。

靈芝、杏鮑菇混合發(fā)酵培養(yǎng)：分別取靈芝、杏鮑菇單菌種子液5 mL接種于25 ℃牛蒡液體培養(yǎng)基中，在120 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5 d，用苯酚-硫酸法測胞外多糖含量。

1.3.2 白果汁、綠茶汁的制備

1.3.2.1 白果汁的制備

將白果外殼和內(nèi)皮脫去，果肉放在水中進(jìn)行浸泡24 h，在沸水中進(jìn)行預(yù)煮10 min，和水按1:10的質(zhì)量比放在織搗碎機破碎，加入NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.2，加入0.12%的木瓜蛋白酶，攪拌均勻，50 ℃酶解1.5 h，90 ℃水浴鍋中滅酶10 min；冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH至4.0，加入0.08%的α-淀粉酶，攪拌均勻，55 ℃酶解2 h之后取出滅酶，冷卻后再調(diào)節(jié)pH至7.0；真空抽濾得到白果汁[11]。

1.3.2.2 綠茶汁的制備

將綠茶放入一定量的燒杯中，按1:50的質(zhì)量比加入綠茶和蒸餾水，于90 ℃水浴鍋中浸泡10 min，冷卻、過濾得到綠茶汁。

1.3.3 靈芝、杏鮑菇混合發(fā)酵培養(yǎng)單因素試驗

分別改變培養(yǎng)時間（4，5，6，7和8 d），液體培養(yǎng)基牛蒡配比（8%，10%，12%，14%和16%），液體培養(yǎng)基酵母浸膏配比（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%和1.6%），考察各因素對靈芝、杏鮑菇混合發(fā)酵胞外多糖的影響。

1.3.4 復(fù)合保健飲料工藝流程[12-13]

靈芝、杏鮑菇菌種活化→靈芝、杏鮑菇單菌液體發(fā)酵培養(yǎng)→靈芝、杏鮑菇混合液體發(fā)酵培養(yǎng)→發(fā)酵液離心、過濾→濾液作為調(diào)配液，添加白果汁、菊花汁、綠茶汁、穩(wěn)定劑、檸檬酸、蔗糖、蜂蜜等調(diào)配→均質(zhì)→灌裝→封口→滅菌→冷卻→成品

1.3.5 復(fù)合保健茶飲料調(diào)配單因素試驗

分別改變發(fā)酵液（5%，10%，15%，20%和25%），白果汁（5%，10%，15%，20%和25%），蔗糖（4%，5%，6%，7%和8%），綠茶汁（4%，10%，16%，22%和28%）的混合比例，考察各因素對茶飲料感官品質(zhì)的影響。

1.3.6 保健飲料調(diào)配的正交試驗設(shè)計

以感官評分為指標(biāo)，選擇發(fā)酵液、白果汁、蔗糖和綠茶汁作為影響因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，因素水平見表1。

1.3.7 保健飲料品質(zhì)檢測

1.3.7.1 感官評價

選擇10名專業(yè)人員對復(fù)合茶飲料進(jìn)行感官評分[14]，評分標(biāo)準(zhǔn)見2。

表2 茶飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.7.2 理化指標(biāo)測定方法

多糖采用苯酚-硫酸法測定，三萜類化合物采用可見分光光度法測定[15]，總酸度采用酸堿滴定法，可溶性固形物采用折光法測定。

鉛采用GB 5009.12—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測定》測定，砷采用GB 5009.11—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機砷的測定》測定。

1.3.7.3 微生物指標(biāo)測定方法

菌落總數(shù)采用GB 4789.2—2016方法測定，大腸菌群采用GB 4789.3—2016方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝、杏鮑菇混合培養(yǎng)條件的選擇

2.1.1 培養(yǎng)時間對胞外多糖含量的影響

從圖1中可以看出，發(fā)酵液中的胞外多糖含量是隨培養(yǎng)時間增加而不斷提高，培養(yǎng)時間在第7天時，胞外多糖含量達(dá)到最大值，為18.35 mg/mL，第8天開始下降，可能是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)因消耗而降低。

圖1 培養(yǎng)時間對胞外多糖含量的影響

2.1.2 培養(yǎng)基牛蒡配比對胞外多糖含量的影響

從圖2可知，隨著培養(yǎng)基中牛蒡量的增加胞外多糖先增加后降低，牛蒡配比10%時，發(fā)酵液中多糖含量達(dá)到最大值，為17.48 mg/mL。

圖2 培養(yǎng)基牛蒡配比對胞外多糖含量的影響

2.1.3 培養(yǎng)基酵母浸膏配比對胞外多糖含量的影響

從圖3中可知，隨著培養(yǎng)基中酵母浸膏的增加胞外多糖先增加后降低，酵母浸膏配比1.0%時，發(fā)酵液中胞外多糖含量達(dá)到最大值，為17.17 mg/mL。

圖3 培養(yǎng)基酵母浸膏配比對胞外多糖含量的影響

2.2 保健茶飲料調(diào)配單因素試驗條件選擇

2.2.1 發(fā)酵液添加量對感官評價的影響

根據(jù)圖4可知，發(fā)酵液比例10%時，感官評價分達(dá)到最大值，為90分。發(fā)酵液比例超過10%時，感官評分值下降，原因可能是發(fā)酵液過多時，過濃的發(fā)酵液味導(dǎo)致飲料口感評分下降，下咽時有靈芝的苦味。因此，選擇發(fā)酵液比例5%，10%和15%為正交試驗的水平。

圖4 發(fā)酵液添加量對感官評價的影響

2.2.2 白果汁添加量對感官評價的影響

根據(jù)圖5可知，白果汁比例10%時，感官評價分達(dá)到最大值，為91分。白果汁比例超過10%時，感官評分下降，可能是因為白果汁過濃影響了飲料的口感。因此，選擇白果汁比例5%，10%和15%為正交試驗的水平。

圖5 白果汁添加量對感官評價的影響

2.2.3 蔗糖添加量對感官評價的影響

根據(jù)圖6可知，隨著蔗糖添加量的增加感官評分先增加后降低，蔗糖比例6%時，感官評價分達(dá)到最大值，為92分，酸甜適宜。因此，選擇蔗糖比例5%，6%和7%為正交試驗的水平。

圖6 蔗糖添加量對感官評價的影響

2.2.4 綠茶汁添加量對感官評價的影響

根據(jù)圖7，隨著綠茶汁添加量增加，感官評分值也逐漸增大，添加量16%時，感官評價分達(dá)到最大值，為92分，比例超過16%時，感官評分值下降。綠茶汁過濃時，綠茶味過重，導(dǎo)致飲料的口感下降。因此，選擇綠茶比例10%，16%和22%為正交試驗的水平。

圖7 綠茶汁添加量對感官評價的影響

2.3 復(fù)合保健茶飲料調(diào)配正交試驗

保健飲料口感調(diào)配優(yōu)化正交試驗，結(jié)果見表3。

復(fù)合保健茶飲料最優(yōu)調(diào)配方案為A3B2C3D2，即發(fā)酵液15%、白果汁10%、蔗糖7%、綠茶16%，根據(jù)極差分析，各因素對飲料感官影響程度的主次順序是A＞D＞B＞C，即發(fā)酵液＞綠茶汁＞白果汁＞蔗糖。按最優(yōu)方案調(diào)配復(fù)合茶飲料，進(jìn)行感官評定，感官綜合評價為94分。復(fù)合茶飲料呈淺黃色，酸甜適中，具有靈芝、杏鮑菇、白果汁、牛蒡和菊花特有的復(fù)合香氣與滋味，營養(yǎng)豐富、功效齊全。

表3 保健茶飲料調(diào)配正交試驗結(jié)果

2.4 飲料品質(zhì)檢測結(jié)果

2.4.1 感官指標(biāo)檢測結(jié)果

色澤：呈淡黃色，均勻一致。香氣和滋味：既有靈芝和杏鮑菇獨特風(fēng)味，又有白果、菊花、綠茶香氣和滋味，風(fēng)味純正。組織狀態(tài)：透明澄清，久置無沉淀?？诟校焊士噙m宜，口感較好，下咽時留有余香。

2.4.2 理化指標(biāo)檢測結(jié)果

多糖含量6.94 mg/mL，三萜類化合物含量0.041 3 mg/mL，總酸含量0.523 g/100 mL，茶多酚含量363.46 mg/kg，可溶性固形物含量10.30%；鉛含量0.023 mg/L，砷含量0.050 mg/L，鉛和砷含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3 微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

菌落總數(shù)為2.20×104CFU/mL，未檢出大腸桿菌，符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

靈芝、杏鮑菇混合發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間7 d、液體培養(yǎng)基牛蒡配比10%、液體培養(yǎng)基酵母浸膏配比1.0%時，混合發(fā)酵液中胞外多糖含量最高。

通過單因素和正交試驗優(yōu)化復(fù)合保健茶飲料調(diào)配條件，最佳配方為：發(fā)酵液15%、白果汁10%、蔗糖7%、綠茶16%。經(jīng)均質(zhì)、罐裝、滅菌、冷卻得到成品。產(chǎn)品透明澄清，呈淡黃色，既有靈芝和杏鮑菇獨特風(fēng)味，又有白果、菊花、綠茶復(fù)合香氣與滋味，風(fēng)味純正，酸甜適宜，口感好，營養(yǎng)齊全，符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。