史亞萍，張玉，張綿松，賈愛榮，王加祥，劉昌衡*

山東省科學(xué)院生物研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250014）

海參是海洋棘皮動(dòng)物，屬于海參綱，在世界各大海洋中均有廣泛的分布，在我國沿海地區(qū)也有多個(gè)種類的分布。自古以來，海參即是十分貴重的營養(yǎng)保健品，人們一直都有食用海參的習(xí)慣。海參肽是指從海參中提取的具有特殊生理功能的活性肽，可以是由2～12個(gè)氨基酸組成的小肽或是分子量更大的多肽。海參肽生物利用率高，比氨基酸更易吸收[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)海參肽具有降血壓、抗氧化、抗腫瘤及抗疲勞等多種功能，且其生理活性可能與海參肽分子量分布有一定的關(guān)系[3]。劉程慧等[4]研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在1～3 kDa海參肽對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力；王靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)提取自溶酶酶解海參產(chǎn)生的不同分子量海參肽對活性氧（ROS）具有較強(qiáng)清除能力，分子量小于3 kDa海參肽清除能力最強(qiáng)。付學(xué)軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)清除超氧陰離子的海參肽分子量主要分布在5 kDa以下。目前對于在不同體系下，海參肽抗氧化活性與分子量關(guān)系的系統(tǒng)性研究較少。

試驗(yàn)采用生物酶解法，將海參蛋白酶解成多肽，并對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。對酶解產(chǎn)物采用超濾法分離不同分子量海參肽，最后在多種體系下，對不同分子量海參肽進(jìn)行體外抗氧化活性研究，比較分析不同體系下海參肽抗氧化活性與分子量關(guān)系，旨在為利用海參開發(fā)功能食品，促進(jìn)海參資源開發(fā)利用與工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參，產(chǎn)自山東威海。水產(chǎn)蛋白酶（30萬 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限公司；中性蛋白酶（5.7萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（6.8萬 U/g）、堿性蛋白酶（30萬U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.3萬 U/g）、胰蛋白酶（5.3萬U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（8.9萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

JSP-350 A高壓多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）；YXQ-LS-60 SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FA 1004 N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ST 3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器（常州）有限公司；RE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；F 12冷凍循環(huán)器（Julobo公司）；XX 80 EL 005超濾系統(tǒng)（MILLIPORE公司）；MD 44-5 M透析袋（MYM生物技術(shù)有限公司）；RETBS 025磁力攪拌器（IKA公司）；CR 22 GⅢ冷凍離心機(jī)（Hitachi集團(tuán)）；M 200 pro多功能酶標(biāo)儀（TECAN公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解試驗(yàn)

1) 蛋白酶種類的確定。新鮮海參清洗，去除內(nèi)臟，熱水漂燙，瀝干稱質(zhì)量，加5倍水粉碎打漿，過膠體磨磨細(xì)。將海參漿加熱至100 ℃，保溫10 min，待冷卻后，將海參液分為7等份，選用復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、水產(chǎn)蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶在各自適宜的條件下進(jìn)行酶解，酶解后于100 ℃保溫10 min滅酶，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行水解度測定，每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。以水解度為指標(biāo)，選擇水解度最大的酶做后續(xù)研究。

2) 單因素試驗(yàn)。分別考察酶解時(shí)間、料液比和加酶量對水解度的影響。水解完成后于100 ℃保溫10 min滅酶，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行水解度測定。

3) 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。為了優(yōu)化海參多肽的提取工藝，參考李莉等[7]的方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定酶解時(shí)間、料液比和加酶量3個(gè)單因素的水平分別為：加酶量（0.4%，0.6%和0.8%）、料液比（1∶3，1∶5和1∶7 g/mL）、酶解時(shí)間（2，4和6 h）。以料液比、加酶量和酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，水解度為響應(yīng)值，用Design Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，分析研究這3個(gè)因素對提取工藝的影響。

1.2.2 水解度的測定

水解度的測定參考TNBS法[8-9]。

式中：海參蛋白為8.0 mmol/g。

1.2.3 3種分子量海參多肽體外抗氧化活性的研究

海參經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解后，酶解液通過超濾得到分子量大于3 kDa，1～3 kDa和小于1 kDa 3種海參多肽，經(jīng)過冷凍干燥后得到固體樣品，然后在ABTS+·清除能力、還原能力、O2-·清除能力、DPPH·清除能力4種體系下研究并比較三者的體外抗氧化活性。

ABTS+·清除活性的測定參考劉薇等[10]的方法。

ABTS+·清除能力的測定：將20 μL質(zhì)量濃度為100，50，25，10和1 mg/mL的樣品溶液、空白（甲醇）分別加到離心管中，再加入800 μL新鮮配制的ABTS+工作液，室溫條件下，避光孵育5 min。各取200 μL加到96孔板中，用酶標(biāo)儀于734 nm波長下檢測，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

式中：AS為樣品溶液吸光度，AO為空白溶液吸光度。

還原力的測定參考陳英等[11]的方法。

準(zhǔn)確量取0.2 mL質(zhì)量濃度為100，50，25，10和1 mg/mL的待測樣品的水溶液及空白溶液（蒸餾水），再加入0.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）及0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，于50 ℃水浴孵育20 min；再加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液，室溫孵育10 min；以8 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL，再加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻；取200 μL于96孔板，在700 nm處測定吸光度。溶液的吸光度越高，還原力越強(qiáng)，反之越弱。

在離心管中加入3.0 mL Tris-HCl溶液，然后分別加入0，1，2，4，8和16 mg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)品及樣品各200 μL，充分混勻后精確反應(yīng)4 min，加入500 μL濃鹽酸終止反應(yīng)，于325 nm處測定吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

式中：A空白為Tris-HCl的OD值；A對照為Tris-HCl+鄰苯三酚混合液的OD值；A樣品為樣品的OD值。

4) DPPH·清除活性的測定參考趙玲等[13]的方法。

將30 μL質(zhì)量濃度為100，50，25，10和1 mg/mL的待測樣品的水溶液及空白（蒸餾水）分別加到離心管中，再加入120 μL新鮮配制的DPPH甲醇溶液以及570 μL的甲醇溶液，混合均勻；在室溫下，避光孵育30 min。分別取200 μL加到96孔板，用酶標(biāo)儀于517 nm波長下進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

式中：AS樣品溶液吸光度，AO空白溶液吸光度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

以上重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值。采用SAS軟件和Design Expert對數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，包括顯著性差異分析、方差分析以及最佳試驗(yàn)條件和最佳響應(yīng)值預(yù)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶種類篩選結(jié)果

將各種蛋白酶在各自適宜條件下對海參進(jìn)行酶解，其酶解效果見表1。其中復(fù)合蛋白酶對海參酶解效果最好，堿性蛋白酶次之，木瓜蛋白酶最差。因此選定復(fù)合蛋白酶進(jìn)行后續(xù)酶解條件優(yōu)化。

表1 不同蛋白酶的水解效果

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 單因素試驗(yàn)

料液比、加酶量和酶解時(shí)間分別對海參酶解效果的影響見圖1。由圖1（a）可知，當(dāng)料液比為1:3～1:5（g/mL）時(shí)，水解度隨料液比增大而不斷提高；當(dāng)料液比為1:5（g/mL）時(shí)，水解度最大，此后繼續(xù)增大料液比，水解度稍有下降。由圖1（b）可知，當(dāng)加酶量為0.4%～0.8%時(shí)，水解度隨加酶量增大而不斷提高；當(dāng)加酶量超過0.8%時(shí)，水解度變化不大。由圖1（c）可知，當(dāng)酶解時(shí)間為2～4 h時(shí)，水解度隨加酶解時(shí)間增加而不斷提高；當(dāng)酶解時(shí)間超過4 h時(shí)，水解度變化不大。

圖1 料液比、加酶量和酶解時(shí)間分別對海參蛋白水解度的影響

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、加酶量和酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，水解度為響應(yīng)值，用Design Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，分析研究這3個(gè)因素對提取工藝的影響。

2.2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

采用Design Expert 8.0軟件對水解度響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合，建立二次回歸模型，得回歸方程：Y=21.21-0.27A+1.73B-0.32C+0.66AB-0.34AC+0.52BC-3.11A2-1.84B2-3.08C2。

對上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。R2=0.997 2，說明試驗(yàn)擬合程度良好；失擬項(xiàng)的p=0.331 6，說明模型失擬項(xiàng)不顯著；校正系數(shù)=0.993 5，說明此模型可用來分析海參蛋白水解度。此外，料液比B對水解度有極顯著影響；交互作用項(xiàng)AB、BC、A2、B2和C2均對水解度有顯著影響；其他變量的影響均不顯著。由表3可知，影響水解度的因素順序?yàn)锽（料液比）＞C（酶解時(shí)間）＞A（加酶量）。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析

兩因素間的交互效應(yīng)分析見圖2。

2.2.2.3 最優(yōu)值預(yù)測及方法預(yù)測

軟件解析得出海參蛋白酶解的最佳條件：加酶量0.79%，料液比1:5.36（g/mL），酶解時(shí)間3.93 h。在此條件下，海參蛋白水解度的理論值為21.38%；實(shí)際操作，酶解時(shí)間4 h，3次重復(fù)試驗(yàn)測出海參蛋白水解度為21.12%，與理論值相比，相對誤差為1.21%。

2.3 3種分子量的海參肽體外抗氧化活性的比較

2.3.1 ABTS+·清除活性

3種不同分子量海參肽ABTS+·清除率見圖3。3種分子量海參肽都有ABTS+·清除活性；在質(zhì)量濃度為1～50 mg/mL范圍內(nèi)，ABTS+·清除能力隨著海參肽濃度的升高不斷增大；在質(zhì)量濃度為50～100 mg/mL范圍內(nèi)，ABTS+清除能力隨著海參肽濃度的升高增加不明顯，曲線趨于平緩；其中分子量小于1 kDa海參肽ABTS+·清除能力最強(qiáng)，分子量1～3 kDa海參肽ABTS+·清除能力次之，分子量大于3 kDa海參肽ABTS+·清除能力最弱。

圖2 兩因素間的交互效應(yīng)分析

圖3 不同分子量海參肽的ABTS+·清除活性

2.3.2 還原力的測定

3種不同分子量海參肽的還原力結(jié)果見圖4。吸光度越高，還原力越強(qiáng)，反之越弱。從圖4可以看出，3種分子量海參肽都有顯著還原能力，在質(zhì)量濃度為0.1～100 mg/mL范圍內(nèi)，還原能力隨著海參肽濃度的升高不斷增大，其中分子量大于3 kDa海參肽還原能力最強(qiáng)，分子量1～3 kDa海參肽還原能力次之，分子量小于1 kDa海參肽還原能力最弱。

圖4 不同分子量海參肽的還原力

同質(zhì)量濃度（1 mg/mL）下，3種不同分子量海參肽以及維生素C的清除率見表4。分子量小于1 kDa海參肽清除活性最強(qiáng)，1～3 kDa海參肽次之，分子量大于3 kDa海參肽最弱；此外三者清除活性均低于維生素C。

表4 清除率

表4 清除率

?

2.3.4 DPPH·清除活性

3種不同分子量海參肽DPPH·清除率見圖5。3種分子量海參肽都具有DPPH·清除活性。在質(zhì)量濃度為1～100 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH·清除能力隨著肽濃度的升高不斷增大。其中分子量大于3 kDa海參肽DPPH·清除能力最強(qiáng)，分子量1～3 kDa海參肽次之，分子量小于1 kDa海參肽最弱。

圖5 不同分子量海參肽的DPPH·清除活性

3 結(jié)論

為獲得多肽含量高的海參蛋白酶解液，試驗(yàn)研究了復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、水產(chǎn)蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解法對海參蛋白的水解能力，最后確定以復(fù)合蛋白酶為最佳用酶。又以料液比、加酶量、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，水解度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析得出海參蛋白酶解最佳條件為加酶量0.79%、料液比1:5.35（g/mL）、酶解時(shí)間3.93 h，在此條件下，海參蛋白水解度為21.38%。通過超濾分別得到分子量大于3 kDa，1～3 kDa和小于1 kDa 3種海參肽，冷凍干燥后，在ABTS+·清除能力、還原能力、DPPH·清除能力、清除能力4種體系下比較三者體外抗氧化能力。結(jié)果顯示，分子量小于1 kDa海參肽對ABTS+·、清除活性最高，1～3 kDa海參肽次之，大于3 kDa海參肽最弱；分子量大于3 kDa海參肽還原能力以及對DPPH·清除活性最強(qiáng)。此次研究結(jié)果為利用海參資源開發(fā)具有抗氧化功效功能食品提供了理論依據(jù)。