王愛軍

上海食品科技學(xué)校（上海 201599）

焦糖色素是一種廣泛使用的食品色素，其色澤口感好，且性質(zhì)較為穩(wěn)定，在調(diào)味品、飲料等食品中應(yīng)用廣泛[1-2]。氨法生產(chǎn)焦糖色素時(shí)會(huì)產(chǎn)生4-甲基咪唑（4-MI）。4-MI為神經(jīng)毒性物質(zhì)，對小鼠的LD50值為370 mg/kg[3-4]。此外，4-MI可致驚厥作用，能誘發(fā)癲癇癥、肝癌或甲狀腺腫瘤[3,5-8]。為了加大對食品質(zhì)量安全的監(jiān)管力度，建立快速有效地檢測焦糖色中4-MI含量的方法具有重要意義。

檢測4-MI較為經(jīng)濟(jì)的方法是紙層析法[9-10]，這種方法是利用目視定量，其誤差大。使用分光光度法測定，操作繁瑣，雜質(zhì)干擾大，難以準(zhǔn)確定性定量[5]。GB 1886.64—2015[11]將焦糖色的檢驗(yàn)方法變更為氣相色譜法，然而無論是使用FID檢測器[11]或NPD檢測器[12-13]，樣品富集倍數(shù)高，定量結(jié)果不準(zhǔn)確。高效液相色譜法需要對樣品進(jìn)行衍生，分析結(jié)果重復(fù)性低[14]。使用串接質(zhì)譜能夠有效降低雜質(zhì)干擾，獲得較低的檢出限[15]，前處理使用柱層析，增加前處理的成本和時(shí)間。

QuEChERS前處理方法主要應(yīng)用于農(nóng)藥及獸藥殘留檢測，逐漸被應(yīng)用于微量化合物的分析測定，具有針對性[16]。試驗(yàn)基于QuEChERS前處理技術(shù)，建立適合測定焦糖色中4-MI的快速前處理方法。同時(shí)重新優(yōu)化質(zhì)譜條件，提高檢測準(zhǔn)確性。該方法主要針對檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對焦糖色中4-MI含量進(jìn)行快速測定和判定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

焦糖色（普通法生產(chǎn)，市售）；4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品（98%，美國Acros Organics）；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、無水硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）；硅藻土（美國Supelco）；實(shí)驗(yàn)用水為三級水。

氣相色譜儀（Agilent，7890B）；三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電子轟擊離子源（EI）（Agilent，7000）；旋渦混合器（Vortex Mixer QL-866）。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.000 1 g）焦糖色于50 mL旋蓋離心管，加入2 mL 0.3 moL/L的NaOH溶液，攪拌均勻，加入2.5 g硅藻土后旋緊蓋子劇烈振蕩，使硅藻土與試樣混合均勻，繼續(xù)加入20 mL乙酸乙酯后旋緊蓋子于漩渦振蕩儀振蕩50 s，取上清液通0.45 μm的微孔濾頭過濾，待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取約0.100 43 g 4-MI標(biāo)準(zhǔn)品，加入二氯甲烷充分溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，配置成濃度1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃條件下保存。準(zhǔn)確移取上述儲備液，加二氯甲烷配置成1 mL上機(jī)液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱Agilent HP-5MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣He（99.999%）；碰撞氣N2；恒流模式，柱流量1.5 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱初始溫度60 ℃，保持2 min，程序升溫以20 ℃/min至140 ℃，后運(yùn)行柱流量3 mL/min，300 ℃保持8 min。

質(zhì)譜條件：離子源，EI源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度300 ℃；電子能量70 eV；溶劑延遲4 min；掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。母離子、子離子、碰撞能量、保留時(shí)間見表1。

表1 母離子、子離子、碰撞能量及保留時(shí)間

1.5 測定方法

取樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 μL，通過自動(dòng)進(jìn)樣器注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，得到4-MI產(chǎn)物離子圖（見圖1），以保留時(shí)間和二級質(zhì)譜特征碎片離子m/z 54.1、55.0定性，以定量離子m/z 55.0的峰面積外標(biāo)法計(jì)算樣品中4-MI含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二級質(zhì)譜條件優(yōu)化

4-MI分子量82，全掃描獲得的質(zhì)譜圖（見圖2）主要m/z有82.0，81.0和54.1，其中選擇m/z較大的碎片82.0和81.0優(yōu)化碰撞能量（見表2）。

從表2看出，m/z 54在各種條件下均能獲得較高豐度，該碎片容易獲得，因而抗干擾能力弱。m/z 55僅在選取母離子m/z 82.0時(shí)產(chǎn)生，該碎片能更好地體現(xiàn)4-MI特征，并且在碰撞能量5 V時(shí)相對m/z 54有較高豐度，因而選擇m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）為定量離子。為了更多地體現(xiàn)4-MI碎片特征，選取另一母離子的離子對m/z 81.0→54.1作為定性離子，在碰撞能量25 V時(shí)m/z 54.1豐度最接近定量離子豐度，定性準(zhǔn)確性較好，因而選擇m/z 81.0→54.1（碰撞能量25 V）為定性離子。

圖1 4-MI產(chǎn)物離子圖

圖2 4-MI全掃描質(zhì)譜圖

表2 4-MI二級質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果

2.2 浸提溶劑種類的優(yōu)化

分別稱取等量焦糖色，與2.5 g硅藻土混合均勻后，加入20 mL提取溶劑，立即渦旋萃取30 s，比較正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈的浸提效果（見表3）。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取效果最佳，30 s萃取回收率達(dá)77.5%。此外，甲醇、乙醇極性較大，浸提后提取液顏色呈棕色，無法有效去除雜質(zhì)，所以不適合作為浸提溶劑。

2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

分別考察不同渦旋時(shí)間對4-MI提取能力。如圖3所示，提取時(shí)間在5～40 s之間，提取液中4-MI與提取時(shí)間呈正相關(guān)，提取時(shí)間越長，提取液中4-MI含量越高；提取時(shí)間大于40 s，隨著提取時(shí)間延長，提取液中4-MI含量保持穩(wěn)定，說明提取達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，繼續(xù)增加提取時(shí)間對提取率增加沒有效果。為保證提取率穩(wěn)定，最佳提取時(shí)間為50 s。

表3 不同種類溶劑浸提效果

圖3 渦旋時(shí)間對4-MI提取效果

2.4 線性范圍、定量限、精密度、回收率

配制0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和20.0 μg/mL 4-MI標(biāo)準(zhǔn)系列濃度進(jìn)行測定，以定量離子峰面積S為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（強(qiáng)制過原點(diǎn)），4-MI標(biāo)準(zhǔn)溶液在范圍內(nèi)，線性回歸方程為S=323.739 270c，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，線性較好。按照3倍性噪比計(jì)算檢出限，儀器檢出限為0.5 μg/mL，稱樣量為2 g時(shí)，方法檢出限為5 mg/kg，滿足焦糖色中4-MI含量檢驗(yàn)要求（限量值200 mg/kg[11]）。對空白焦糖色素樣品加標(biāo)，考察了3個(gè)加標(biāo)水平（5，100和200 mg/kg），每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次，計(jì)算測得樣品的加標(biāo)回收率為78.3%～91.7%，通過相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）衡量試驗(yàn)精密度，RSD值為2.11%～7.12%（見表4），符合痕量分析要求。

表4 4-MI加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立焦糖色中4-MI含量檢測方法。在前處理方面，針對焦糖色基質(zhì)采用硅藻土吸附劑進(jìn)行凈化，應(yīng)用QuEChERS技術(shù)對微量化合物進(jìn)行分析測定，且經(jīng)過方法優(yōu)化后，對4-MI提取和凈化效果有明顯針對性，降低前處理的成本和時(shí)間。由于4-MI分子量低，特征峰抗干擾能力弱，單級質(zhì)譜仍無法有效地排除小分子雜質(zhì)的干擾。應(yīng)用串接質(zhì)譜能夠有效降低雜質(zhì)干擾，并且選取僅在選取母離子m/z 82.0時(shí)產(chǎn)生m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）為定量離子，該碎片能更好地體現(xiàn)4-MI特征，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。

基于QuEChERS前處理技術(shù)，建立適合測定焦糖色中4-MI的快速前處理方法。同時(shí)重新優(yōu)化質(zhì)譜條件，利用更多母離子信息對目標(biāo)物4-MI進(jìn)行準(zhǔn)確定性，進(jìn)一步降低雜質(zhì)干擾，從而減少濃縮倍數(shù)，簡化前處理，提高檢測準(zhǔn)確性。該方法主要針對檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對焦糖色中4-MI含量進(jìn)行快速測定和判定。