郭楠楠，段秋虹

鄭州科技學(xué)院，鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室（鄭州 450064）

硒是人和動物所必需的微量元素[1]，硒在自然界中存在的形式是無機硒和有機硒，近幾年，含硒樣品的種類越來越多，檢測的手段也各有不同，中華人民共和國國家標準GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》中規(guī)定了食品中硒含量的測定方法，主要有氫化物原子熒光光譜法、分光光度法、熒光分光光度法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[2]。與這些測定方法相比，催化動力學(xué)光度法具有儀器簡單、測定費用較低、靈敏度高等優(yōu)點[3]，因此，試驗探討了催化動力學(xué)光度法對食品中硒含量的測定條件及動力學(xué)條件，建立一種測定食品中痕量硒的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳、核桃、紅小豆（市售）；100 mg/L硒標準溶液（用時稀釋至0.1 μg/mL，中國·派尼化學(xué)試劑廠）；亞甲藍（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；溴酸鉀（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；硝酸溶液（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；鹽酸（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；硫酸（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S型水浴鍋（0～100 ℃），鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101-OABS電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司，UV-4802紫外可見光分光光度計，上海悅豐儀器儀表有限公司；電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將黑木耳、核桃、紅小豆用水洗凈，在65～70 ℃條件下，在烘箱中烘干樣品，粉碎完全。用電子天平稱取1.000 g粉碎好的樣品于錐形瓶中，添加少量的水潤濕，再加入25 mL 1:4的高氯酸-硝酸混酸，在室溫下靜置過夜，在錐形瓶中加入2～3粒玻璃珠，在可調(diào)式電熱爐上緩慢加熱，并補加硝酸，直至試樣溶液呈透明。溶液冷卻后，加入20 mL 1:1的硫酸溶液，后轉(zhuǎn)入分液漏斗中，依次加入1.5 g的溴化鉀（溴化鉀需要先用少量的水溶解）、3 mL的磷酸溶液，混勻后加入25 mL的苯，振蕩1 min，分層后將水相移入另一份液漏斗中，再加入25 mL的苯重復(fù)萃取一次，合并有機相，用50 mL的水反萃取硒兩次，將兩次的有機相合并于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。

1.3.2 樣品分析方法

取兩根相同的25 mL的具塞的比色管，在其中的一根中加入1.5 mL的硒標準使用液做催化反應(yīng)，另外一根中不加硒標準使用液，再依次分別加入2.00 mL硝酸溶液、2.00 mL亞甲藍溶液、2.50 mL溴酸鉀溶液，再加入蒸餾水，稀釋至刻度線，振搖混合均勻，置于75 ℃水浴中加熱5 min，立即取出置于流水中冷卻至室溫。冷卻至室溫后，以水作參比，用1 cm比色皿在665 nm處分別測定出非催化反應(yīng)溶液的吸光度A0和催化反應(yīng)溶液的吸光度A，計算出ΔA。

1.4 樣品中硒含量的測定

在比色管中依次加入2.00 mL硝酸、2.00 mL亞甲藍溶液、2.5 mL溴酸鉀溶液，加水稀釋至25 mL測定它的吸光度，記為空白值。吸取5.00 mL經(jīng)處理的樣品消化液于25 mL的比色管中，再在比色管中依次加入2.00 mL硝酸溶液、2.00 mL亞甲藍溶液、2.5 mL溴酸鉀溶液，用蒸餾水稀釋至刻度25 mL，輕輕地搖勻并混合均勻，將搖勻的比色管置于75 ℃的恒溫水浴箱中連續(xù)加熱5 min，水浴加熱完成后，在冷水的作用下，將比色管置于冷水流下冷卻至室溫。再用紫外分光光度計測定它的吸光度。在待測樣液中分別加入0.1和0.2 μg的硒標準樣液，測定其吸光度，計算樣品中硒的含量及回收率。

1.5 樣品中硒含量的計算

根據(jù)標準曲線方程計算樣品中硒濃度，根據(jù)硒的濃度計算出樣品中硒的含量。

式中：X為試樣中硒含量，mg/kg；ρ為試樣中硒的質(zhì)量濃度，mg/kg；m為試樣質(zhì)量，g；V1為試樣用比色皿的體積，mL；V2為樣品消解后定容體積，mL；V3為移取消化液的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長對硒吸光度的影響

用紫外分光光度計測定不同波長情況下，溶液的不同的吸光度。在紫外分光光度計上的多波長設(shè)置中，分別設(shè)置波長655，660，665，670，675和680 nm，按1.3.2進行試驗。觀察試驗現(xiàn)象并記錄試驗數(shù)據(jù)，具體結(jié)果見圖1。催化反應(yīng)與非催化反應(yīng)的最大吸收波長為665 nm處，可看出在665 nm處為最適合的測定波長。

2.2 試驗條件的選擇及工作曲線的確定

2.2.1 酸度的選擇

用吸量管分別吸取1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL 0.025 mol/L的硝酸溶液于5根25 mL比色管中。按照試驗方法測定其吸光度。結(jié)果見圖2。硝酸的最適用量為2.00 mL，此時ΔA最大，所以試驗選擇硝酸的用量為2.00 mL。

圖1 吸收波長對硒吸光度的影響

圖2 硝酸用量對反應(yīng)的影響

2.2.2 亞甲藍用量的選擇

固定其他的條件，分別取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL亞甲藍溶液，具體結(jié)果見圖3。在亞甲藍用量不斷增加的情況下，吸光度也在不斷地增加，ΔA先緩慢增加，當亞甲藍的用量為2.00 mL時，ΔA最大，隨后ΔA降低。試驗結(jié)果表明：亞甲藍溶液的最適使用量為2.00 mL。

圖3 亞甲藍用量對反應(yīng)的影響

2.2.3 溴酸鉀用量的選擇

固定其他的條件，分別吸取1.50，2.00，2.50，3.00，3.50和4.00 mL溴酸鉀溶液。具體結(jié)果見圖4。由圖4可知，ΔA的變化隨著溴酸鉀加入量的增加而增大，溴酸鉀在2.50 mL后增長變緩，所以選擇溴酸鉀用量2.50 mL。

圖4 溴酸鉀用量對反應(yīng)的影響

2.2.4 反應(yīng)溫度的選擇

反應(yīng)溫度發(fā)生改變，吸光度隨之發(fā)生變化。為了得出溫度對體系的影響，將其他條件固定，分別選取不同的溫度（65，70，75，80和85 ℃），結(jié)果見圖5。隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，ΔA也在不斷地升高，在75 ℃時達到最大值，試驗結(jié)果表明：試驗在室溫下幾乎不發(fā)生反應(yīng)，故選擇最適反應(yīng)溫度75 ℃。

圖5 溫度對反應(yīng)的影響

2.2.5 水浴時間的選擇

其他條件固定，設(shè)定水浴加熱時間2，3，4，5，6和7 min，具體結(jié)果見圖6。由圖6可知，ΔA隨著反應(yīng)時間的不同先變化不明顯后來又增大而后又減小，此現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是時間差的選擇過小，導(dǎo)致變化不明顯。在5～6 min之間，ΔA處于上升期，考慮在5 min時吸光度較大，故選擇水浴時間5 min。

圖6 水浴時間對反應(yīng)的影響

2.2.6 工作曲線

在確定了最佳反應(yīng)條件后，固定其他條件不變，通過改變硒的加入量進行試驗，分別取0，1，2，3，4和5 mL的硒標準使用液。由圖7可知，工作曲線回歸方程為y=5.742 9x-0.002 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，方法的準確度及靈敏性較好，適用于測定食品中的痕量硒。

圖7 標準曲線

2.3 樣品結(jié)果分析

按1.4小節(jié)所述方法，分別檢測黑木耳、核桃、紅小豆中硒含量，具體結(jié)果見表1～表3。

表1 黑木耳含硒量的結(jié)果分析

表2 核桃含硒量的結(jié)果分析

表3 紅小豆含硒量的結(jié)果分析

通過上述分析可以得出，試驗所選用的最適波長為665 nm，稀硝酸的用量為2.00 mL，溴酸鉀的用量為2.50 mL，亞甲藍的用量為2.00 mL，在75 ℃水浴中加熱5 min，黑木耳的含硒量為3.78 μg/100 g，核桃的含硒量為4.24 μg/100 g，紅小豆的含硒量約為3.76 μg/100 g。測定結(jié)果的相對標準偏差在10%左右，回收率在80%～110%之間，符合國標規(guī)定，結(jié)果較好。

2.4 催化動力學(xué)光度法與熒光分光光度法測定結(jié)果比較

取樣品黑木耳、核桃、紅小豆，在相同的消化條件下，分別使用催化動力學(xué)光度法和國標GB 5009.93—2017第二法熒光分光光度法，進行6次平行測定，以此來檢測方法的精密度，最終測定的相對標準偏差均小于0.1，符合誤差允許的范圍。對兩種方法進行F檢驗，所得F值均小于F表（p=95%），說明兩種方法在精密度上不存在顯著性差異。具體結(jié)果見表4。

表4 方法的精密度

2.5 測定方法的檢出限及定量限

對試劑空白進行11次平行測定，按公式MDL=3×S計算檢出限MDL，按公式MQL=10×S計算定量限MQL，式中S為重復(fù)測空白中硒11次的標準偏差。結(jié)果見表5。

表5 檢出限與定量限

3 結(jié)論

通過上述分析可得出結(jié)論：催化動力學(xué)光度法測定食品中硒含量的最適波長為665 nm，稀硝酸的用量為2.00 mL，溴酸鉀的用量為2.5 mL，亞甲藍的用量為2.00 mL，在75 ℃水浴中加熱5 min，黑木耳的含硒量為3.78 μg/100 g，核桃的含硒量為4.42 μg/100 g，紅小豆的含硒量約為3.78 μg/100 g。加標回收率在80%～110%之間，檢出限為0.015 μg/L，方法與國標第二法相比在精密度上不存在顯著性差異。與國標中方法相比，方法操作簡單，所用儀器價廉易得，準確性較高，成本花費較少。