馮拓，李超*，單培，彭成海，吳亞飛，張茜

徐州工程學院食品工程學院（徐州 221018）

香菇加工的下腳料——香菇柄，約占香菇總質量的30%，其中蛋白質約19%，可溶性多糖4%，纖維素65%和脂肪2.6%。從數據可以看出，香菇柄中含有豐富的蛋白質，與蛋白含量較高的牛肉、雞肉等相比，香菇柄是一種很好的植物性蛋白來源。但是，由于香菇柄纖維化程度高、適口性差，往往被制成動物飼料或肥料甚至被當作廢棄物料，造成環(huán)境污染和資源浪費[1]。目前，傳統(tǒng)的蛋白質提取方法主要是堿溶酸沉法，提取率低、提取時間長，且容易造成活性物質結構和性質等發(fā)生改變；而超聲波輔助提取則利用機械效應對原料有很強的破壞作用，可使細胞組織變形；利用空化效應，介質內部氣泡形成共振腔，共振腔的閉合產生微激波，可造成植物細胞壁及整個生物體的破裂，增加溶質穿透力；利用熱效應增大藥物有效成分的溶解速度，從而提高提取率，縮短提取時間[2-4]。針對香菇柄的現狀，以蛋白質得率為指標，通過單因素和響應面試驗，研究超聲波輔助堿液提取香菇柄中水溶性蛋白的影響，優(yōu)化其提取工藝，以期為香菇柄水溶性蛋白的進一步深加工提供原料來源，對促進香菇資源的深度開發(fā)，延伸產業(yè)鏈，減少環(huán)境污染具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

香菇柄（河南菇太郎食品有限公司）；無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；濃鹽酸（上海凌峰化學試劑有限公司）；磷酸（西隴化工股份有限公司）；氫氧化鈉（徐州市科翔化學試劑有限責任公司）；考馬斯亮藍G250（國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清白蛋白（南京奧多福尼生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

DFY-1000型搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；XMT-152電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；飛鴿牌TDL-80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；FA-2004型電子天平（上海越平儀器有限公司）；PHS-3C數顯臺式酸度計（上海浦春計量儀器有限公司）；KBS-250型數控超聲波細胞粉碎機（昆山市超聲儀器有限公司）；723C型可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

香菇柄烘干→粉碎→用60目篩過篩→稱取3 g脫脂原料→加一定pH的提取劑（氫氧化鈉溶液）→超聲波輔助提取→離心（4 000 r/min，15 min）→上清液→抽濾→定容→測定蛋白質含量。

1.3.2 工藝優(yōu)化設計

分別以液料比值、pH、超聲功率、超聲溫度和超聲時間為影響因素考察其對得率的影響；根據Box-Behnken試驗設計原理，選取影響顯著的因素進行響應曲面設計與分析，因素水平表見表1。共17個試驗點，其中12個為析因點，5個為中心點。

表1 因素水平表

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程：EY=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β12x1x2+β13x1x3+β23x2x3+β11x12+β22x22+β33x32+ε。其中，EY，得率%；β0，常數項；β1，β2和β3，線性系數；β12，β13和β23，交互項系數；β11，β22和β33，二次項系數；x1，x2和x3，自變量代碼值；ε為隨機誤差。

1.3.3 提取液中蛋白含量測定

考馬斯亮藍法[5-8]。

1.3.4 得率的計算

式中：m0為香菇柄粉的質量，g；m1為提取液中蛋白質的質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比的確定

固定pH 10、超聲功率50 W、超聲溫度40 ℃和超聲時間36 min，以液料比值為考察因素，結果如圖1。液料比值小于16 mL/g時，隨著液料比增加，得率隨之增加；液料比值為16 mL/g時達到峰值，這是因為隨著加入溶劑量增大，溶劑和香菇柄粉末之間的接觸面變大，從而有利于促進水溶性蛋白的溶出；液料比值大于16 mL/g時，得率不再進一步增加，反而在不斷降低，這是因為過高的液料比會大大降低超聲能量在提取液中的分布密度，從而影響水溶性蛋白的溶出。因此，最適提取液料比值為16 mL/g。

2.1.2 pH的確定

固定液料比值16 mL/g、超聲功率50 W、超聲溫度40 ℃和超聲時間36 min，以pH為考察因素，結果如圖2。隨著pH增大，得率也逐漸升高，這是因為pH影響蛋白質之間，以及蛋白質與溶劑間的相互作用，從而影響蛋白質溶解性。考慮到pH超過11時，堿性條件下易導致蛋白質水解甚至氨基酸結構的改變，影響蛋白質的營養(yǎng)價值及功能性質[9]。同時，過強的堿性環(huán)境，會改變蛋白質的營養(yǎng)學特性，生成賴氨酰丙氨酸，引起營養(yǎng)物質的損失[10-11]；除此之外，高堿條件下還會使蛋白質變性和水解；加速美拉德反應，產生黑褐色物質；使提取物中非蛋白質含量增加，分離效果降低[11-12]。因此，最適提取pH為11。

圖1 液料比值的影響

圖2 pH的影響

2.1.3 超聲功率的確定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超聲溫度40 ℃和超聲時間36 min，以超聲功率為考察因素，結果如圖3。超聲功率0～100 W時，隨著超聲功率增大，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，細胞內蛋白質溶出速率增加，得率也逐漸提高；超聲功率100～250 W時，隨著超聲功率增大，得率逐漸下降，主要原因是超聲功率大于100 W時，超聲作用進一步增強，加速提取液流動，從而使物料停留在超聲場中的時間縮短，破壁作用隨之減弱，蛋白質溶出速率減緩，也可能是功率過大引起部分蛋白質的降解。而且對于特定的物質，超聲作用的效果取決于超聲功率和提取物的結構與性質，不同的提取物適宜不同的提取超聲功率[13]。因此，最適超聲功率為100 W。

2.1.4 超聲溫度的確定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超聲功率100 W和超聲時間36 min，以超聲溫度為考察因素，結果如圖4。在試驗溫度范圍內，得率先隨著超聲溫度的增加而增大，在50 ℃時達到最大，之后隨溫度上升得率反而下降。溫度升高，分子之間熱運動加劇，促使提取過程中傳質速率上升，提取速率加快。在溫度相對較低的情況下，超聲空化作用能促使香菇柄組織中水溶性蛋白最大限度溶出。另一方面，提取時蒸汽壓隨溫度的升高而上升，導致空化強度或空化效應下降，從而不利于提取過程的強化，故溫度超過某一限度后，提取率反而下降[14-15]。因此，最適超聲溫度為50 ℃。

圖3 超聲功率的影響

圖4 超聲溫度的影響

2.1.5 超聲時間的確定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超聲功率100 W和超聲溫度50 ℃，以超聲時間為考察因素，結果如圖5。隨著時間延長，得率先顯著增加，這主要是因為隨著超聲時間的延長，超聲波對底物產生的攪拌及空化作用增強，進而導致與淀粉結合緊密的蛋白從淀粉蛋白絡合物中分離出來。超聲處理時間36 min時，得率達到最大；之后隨超聲處理時間的進一步延長，上清液中蛋白的得率略有下降，這可能是由于超聲提取時間過長，超聲波引起蛋白結構變化，使蛋白發(fā)生變性[16]。因此，最適提取時間為36 min。

圖5 超聲時間的影響

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 模型建立及其顯著性檢驗

運用Design Expert V 7.0.0軟件對表2中得率進行擬合，得回歸方程：得率=-6.074+0.45x1+5.75×10-2x2+0.16x3+5×10-4x1x2-6.77×10-4x1x3-2.08×10-4x2x3-1.30×-6.12×-1.55×。

表2 Box-Behnken試驗結果

對此回歸方程進行方差分析并繪制響應圖和等高線，方差分析表見表3。

由表3可知，模型對應的p＜0.01和失擬項對應的p＞0.05，說明模型是可靠的；=0.906 8，說明得率的變化有90.68%來源于液料比值、超聲溫度和超聲時間；S/N=12.12（＞4），也從另一個方面說明該模型是可靠的。同時由表3中p值可知蛋白質得率影響大小的因素主次順序為：液料比值＞提取時間＞提取溫度。

表3 方差分析結果

2.2.2 響應曲面分析

響應圖和等高線見圖6。等高線越偏向橢圓形，說明交互作用越強；反之越偏向圓形，交互作用越弱；同時有閉合的橢圓形或圓形，也說明在所研究的范圍內有最值。由圖6（a）可知，固定超聲時間為48 min時，分別隨著液料比值和超聲溫度的增大，得率均呈先增加后降低趨勢，液料比值在16.2～17.2 mL/g的范圍內，超聲溫度在43～48 ℃的范圍內較適合；等高線呈閉合的圓形和響應面呈凸形，說明液料比值和超聲溫度交互作用較弱且有最大值；由圖6（b）可知，固定超聲溫度為50 ℃時，分別隨著液料比值和超聲時間的增大，得率均呈先增加后降低趨勢，液料比值在16.3～17.3 mL/g的范圍內，超聲時間在44.5～47.5 min的范圍內較適合；等高線呈閉合的圓形和響應面呈凸形，說明液料比值和超聲時間交互作用較弱且有最大值；由圖6（c）可知，固定液料比值為16 mL/g時，分別隨著超聲溫度和超聲時間的增大，得率均呈先增加后降低趨勢，超聲溫度在42.5～48.5 ℃的范圍內，超聲時間在44.5～48.5 min的范圍內較適合；等高線呈閉合的圓形和響應面呈凸形，說明超聲溫度和超聲時間交互作用較弱且有最大值。試驗分析和表3中p值顯示的顯著性一致。

圖6 響應圖和等高線

2.2.3 最佳參數確定

運用JMP V 7.0軟件對所得的回歸方程進行逐步回歸，并且考慮到實際情況，獲得最佳制作工藝參數為：液料比值16.8 mL/g、超聲溫度45.3 ℃和超聲時間46.4 min。此時得率2.84%。進行3次驗證，實際得率2.87%。

3 結論

在單因素試驗基礎上，運用響應面分析法對提取香菇柄中水溶性蛋白的提取條件進行優(yōu)化，得蛋白質得率影響大小的因素主次順序為：液料比值＞提取時間＞提取溫度。其最佳工藝參數為：液料比值16.8 mL/g、超聲時間46.4 min、超聲溫度45.3 ℃。此時蛋白質實際得率為2.87%。研究為香菇加工的下腳料——香菇柄的有效利用和香菇產業(yè)的產品多樣化提供了理論依據。