浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭 州 3 10053

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)隨著人口老齡化而增加，其特征是骨量減少和骨組織的微結構惡化，導致骨骼脆性和骨折[1]。當骨形成和骨吸收之間存在不平衡時，骨代謝疾病就會發(fā)生。當今，OP已成為全球范圍內的嚴重問題。在中國，老年人OP的平均患病率約為15.7%，并且OP人數(shù)隨著總人口增加和人口老齡化而逐漸增加[2]。正因為如此，中國OP的人口將從1997年的8390萬急劇增加到2050年的2.12億[3]。因此，尋求一種有效的OP治療方式已迫在眉睫。相關研究表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在器官和組織的早期發(fā)育中起中心作用，在生理和病理條件下都具有骨重建的潛在作用[4]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smads信號通路在骨骼發(fā)育和修復過程中至關重要，并且BMPs的異位給藥被用于增強人類局部骨再生[5]。Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads可共同調節(jié)成骨，也可以在路徑激活到生物學效應的不同階段相互調節(jié)。針對兩條信號通路的骨質疏松藥物的研究也取得了一定進展。本文將簡要總結Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號通路各位點及其相互作用對OP疾病影響的研究進展，旨在為臨床治療OP提供新思路。

1 Wnt/β-catenin信號通路與骨質疏松相關疾病

1.1Wnt/β-catenin信號傳導通路 在細胞水平上，Wnt激活幾個信號級聯(lián)反應，包括最常研究的經(jīng)典路徑，即Wnt/β-catenin信號通路[6]。當Wnt蛋白結合受體復合物時，該途徑被激活，該受體復合物包括細胞膜受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)rz）家族的7個跨膜受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[7]。該復合體將糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)和酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)動員到膜上，在那里它們使Lrp5/6上的絲氨酸磷酸化，促進信號體的形成，并且招募蓬亂蛋白（dishevelled，Dvl），支架蛋白（axisinhibition，Axin）和腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis Coli，APC）[8]。這將導致 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）釋放，增加其水平，激活的β-catenin轉移到核內，從而使胞內的β-catenin濃度升高，進入細胞核內與T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴樣增強因子（lymphoid enhancer，LEF）相互作用（見圖1A）。在沒有上游Wnt信號的情況下，GSK3β磷酸化β-catenin氨基末端附近的殘基，靶向β-catenin，用于泛素化途徑水解，使胞質和胞核中的β-catenin維持在較低水平[9]（見圖1B）。Dkk1是一種特性良好的分泌型Wnt抑制劑，在許多組織中都具有活性[10]。臨床及實驗數(shù)據(jù)表明，Dkk1抑制Wnt信號傳導進而抑制骨形成[11]。Dkk1一方面可競爭性抑制Wnt配體和LRP5/6受體，另一方面Dkk1能與LRP5/6、Kremen1/2形成三聚體，通過誘導快速的細胞內吞，從而減少細胞膜上的LRP5/6，以此阻斷Wnt信號向胞內傳遞[12]（見圖1C）。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路模型示意圖

1.2Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路與骨質疏松相關疾病的關系 Wnt信號通路因其在骨骼發(fā)育、骨量維持和再生醫(yī)學治療潛力等方面的重要性而成為骨生物學實驗室研究的熱點[11]。在骨骼發(fā)育過程中，Wnt信號參與近端-遠端生長和背腹側肢體模式，隨后參與軟骨、成骨、肌肉和脂肪形成，在MSC譜系承諾和進展中起著關鍵作用，Wnt信號因此影響骨骼發(fā)育的各個方面，包括顱面、肢體和關節(jié)的形成[4]。例如，Lrp5和Lrp6在復合突變小鼠中的表達減少，導致肢體缺損[4]。成骨成熟階段開始清除Wnt蛋白分泌所需的一種伴侶蛋白wntless，可導致由骨形成受損和骨吸收增加引起的嚴重骨質疏松癥小鼠，且這種骨質疏松表型非常嚴重[4]。β-catenin是由細胞質和核蛋白編碼的Ctnnb1基因，它是Wnt/β-catenin信號級聯(lián)中的關鍵環(huán)節(jié)。高水平的持續(xù)活躍的β-catenin抑制成熟破骨細胞和骨吸收，導致骨硬化病[13]。同時，阻斷Wnt/βcatenin信號途徑觸發(fā)成脂分化的啟動[14]。因此，Wnt/β-catenin信號通路的激發(fā)可以促進成骨分化并抑制成脂分化，上述機制共同導致成骨的增加。

Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵信號分子對骨質疏松癥有不同程度的影響。研究報告稱，LRP5基因敲除小鼠脊柱小梁骨的骨密度降低、骨質疏松導致脛骨骨折[15]。然而，由β-catenin基因敲除引起的Wnt信號通路的抑制將影響骨形成，并導致嚴重的骨量丟失[11]。Hill等[16]研究表明，通過條件性地敲除肢體和頭部中間體中的β-catenin，顯示成骨細胞譜系分化需要β-catenin，缺乏β-catenin的成骨細胞前體在分化中被阻斷并發(fā)育成軟骨細胞。Hill等[16]通過體內和體外損失和功能獲得分析表明，β-catenin活性是必要的，足以抑制間充質細胞分化為Runx2和Sox9陽性骨骼前體。因此，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導對于骨骼譜系分化至關重要，可防止成骨細胞轉分化為軟骨細胞。

Dkk1是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵信號分子特異性抑制劑，對骨質疏松癥有很強的治療作用。研究表明，針對性的Dkk1療法可以增加絕經(jīng)后或老年骨質疏松癥、骨發(fā)育不良或癌癥引起的骨量流失[17]，Dkk1反義寡核苷酸可以增加去卵巢大鼠的成骨細胞數(shù)量，減少核因子RANKL的表達，減少破骨細胞的出現(xiàn)，股骨的骨礦物質含量和骨密度得到提高[18]。在研究Dkk1轉基因的小鼠中，發(fā)現(xiàn)Dkk1的高表達會導致嚴重的OP，并且降低成骨細胞的數(shù)量。相反，相比之下，Dkk1敲除小鼠顯示增加骨量和骨質量[18]。這些結果表明Wnt/β-catenin信號通路中的負調控信號分子可能是治療OP的藥物靶點，并成為藥物治療OP的手段之一。

2 BMP-2/Smads信號通路與骨質疏松相關疾病

2.1BMP-2/Smads信號傳導通路 BMPs是一種多功能生長因子，是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中最大的一族[19-20]，是目前公認最強且唯一能夠誘導異位成骨的細胞因子[21-22]。近年來，BMPs在胚胎發(fā)育和成年動物細胞功能中的作用得到了廣泛的研究。BMP I型和II型受體在信號轉導中都是必不可少的。BMPs功能十分廣泛，其中BMP-2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一。信號轉導研究發(fā)現(xiàn)Smads 1、5、8是BMP受體的直接下游分子，在BMP信號轉導中起中心作用。其具體機制為細胞外BMP-2配體可以與BMPRⅡ型受體結合，進而磷酸化BMPRⅠ型受體，活化的BMPRⅠ型受體通過磷酸化BMP特異性R-Smads 1、5和8來傳遞BMP信號[23]，這些R-Smads與Smad 4復合，進入細胞核并作為靶基因轉錄的激活因子和抑制因子起作用[24]（見圖2A）。BMPs受多種細胞因子的調節(jié)，研究證實Noggin是BMPs信號的直接拮抗劑。Noggin是一種分泌的多肽，可結合BMP-2、4和7并使其失效。Noggin和BMP-7的共晶結構表明，Noggin通過阻斷I型和II型結合表位的分子界面來抑制BMP信號[25]，并拮抗BMPs的功能[26]（見圖2B）。

圖2 BMP-2/Smads信號通路模型示意圖

2.2BMP-2/Smads信號傳導通路與骨質疏松相關疾病的關系 BMP-2/Smads信號通路在骨骼發(fā)生和骨形成過程中至關重要。BMPs是骨形成和其他細胞功能的強有力的刺激物，活化BMP-2信號通路能上調多種成骨細胞標志物的表達，缺乏BMP-2、BMP-4的小鼠不能存活。BMP-2純合子突變胚胎，胚胎平均存活時間為7.5～10.5天，并存在心臟發(fā)育缺陷，表現(xiàn)為體腔外心臟發(fā)育異常，缺乏BMP-2和BMP-4的小鼠不能存活[27]。小鼠的遺傳實驗表明，BMP-2，BMP-4和BMP-7在肢體和顱面骨骼的圖案化和發(fā)展中發(fā)揮主要作用[28]。對缺乏BMP-2表達的小鼠的骨祖細胞檢測顯示，它們在增殖能力和分化成具有骨再生能力的全功能成骨細胞方面存在嚴重缺陷[29]。這些結果表明，BMP-2的缺乏阻礙了骨祖細胞向骨細胞的發(fā)展。在臨床應用中，BMP-2已被批準用于由于退行性椎間盤疾病的脊柱融合和用于治療子宮內膜異位骨折[30]。在成骨細胞中特異性刪除Smads 1基因（使用Col1-Cre小鼠）可導致骨量減少，說明內源性BMPs通過Smads 1信號通路調節(jié)骨量[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，在前成骨細胞分化后期，Noggin具有抑制成骨細胞分化的功能，可對已分化的成骨細胞標志物骨涎蛋白和骨鈣素形成完全抑制[32]。Noggin基因突變和缺失會導致多種關節(jié)異常疾病，如近端腳趾關節(jié)融合和多發(fā)骨性聯(lián)合綜合癥，所有這些都是由Noggin突變引起的常染色體顯性遺傳病[33]。所以，抑制Noggin基因的過表達不僅可增加體外培養(yǎng)成骨細胞的成骨作用，還能增加骨量，減少骨折的發(fā)生率。但隨著BMP-2臨床應用范圍的擴大，對其功效、濃度和并發(fā)癥的擔憂也隨之出現(xiàn)[34-35]，特別是脊髓手術后的各種并發(fā)癥[36]，包括椎間盤退行性骨質溶解[37]、軟組織炎癥[38]、根性關節(jié)炎[39]、咽后間隙腫瘤[39]、異位骨化、神經(jīng)壓迫[41]和逆行性射精[42]，提示BMP-2/Smads信號通路中的分子可用于骨質疏松靶標的治療，但其應用時間、濃度也應再繼續(xù)深入研究，以期達到更好的治療骨質疏松的效果。

3 Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads之間的調節(jié)作用

Wnt/β-catenin和BMP-2/Smads信號通路在許多生物學行為中相互重疊、互補或抑制。有研究顯示：BMP-2對成骨細胞胞外基質礦化的影響部分是通過誘導Wnt自分泌/旁分泌環(huán)介導的[43]，Wnt抑制劑Dkk1是成骨細胞中IA型受體（type IA receptor，BMPR1A）BMPR1A信號傳導的下游靶點，成骨細胞中BMPR1A的丟失通過上調Wnt/β-catenin信號傳導增加骨量[44]，提示兩種信號途徑之間存在著復雜的交聯(lián)關系。第一種方式是兩者共同作用于相同的靶基因，從而表現(xiàn)出疊加效應或協(xié)同作用。在細胞內，Smads被發(fā)現(xiàn)與Wnt信號通路相關分子形成復合物，如Dvl、GSK3β、Axin和β-catenin，這些復合物調節(jié)Smads和β-catenin磷酸化和活動[45-46]。Bain等[47]研究顯示，與用BMP-2蛋白處理相似，C3H10T1/2細胞中穩(wěn)定的β-catenin的異位表達或用LiCl激活內源性β-catenin信號傳導誘導堿性磷酸酶mRNA和蛋白質的表達，而堿性磷酸酶mRNA和蛋白質是早期成骨細胞分化的確定標志物，與BMP2蛋白不同，穩(wěn)定的βcatenin不誘導骨鈣蛋白基因表達，這是晚期成骨細胞分化的標志物，BMP2誘導的分化還導致內源性β-catenin信號傳導的激活，因此暗示β-catenin在BMP2介導的成骨細胞分化的早期步驟中。β-catenin和BMP2對C3H10T1/2分化的影響并不完全重疊，這意味著BMP2誘導的分化的某些方面可能是由βcatenin信號傳導介導，而β-catenin也可能參與非BMP2依賴的分化過程。其他研究顯示，經(jīng)典Wnt信號通路增加了成骨誘導因子如BMP2的敏感性，并且能夠增強它們促進成骨礦化和新骨形成的能力[48]。由以上研究可知，Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號通路可相互促進，應進一步加強兩者在骨質疏松之中相互作用的研究，在單一用藥時效果不顯著或副作用較大時，可考慮聯(lián)合用藥。

第二種方式是兩者在生物體發(fā)育過程中存在負性調節(jié)關系。Hill等[49-50]研究表明，當干細胞發(fā)展成成骨細胞前體細胞，最后一定會分化成成骨細胞。在這個階段，Wnt/β-catenin信號通路主要促進成骨細胞增殖并保持其前體細胞狀態(tài)，防止進一步分化。而BMPs信號通路可以刺激成骨細胞前體細胞分化成為成熟的成骨細胞。因此，Wnt/β-catenin和BMP-2/Smads信號通路對成骨細胞前體細胞有相反的作用。最近的研究表明，BMPRIA成骨細胞靶向條件性敲除導致胚胎發(fā)育期間骨量增加，作為BMPRIA的下游效應物Dkk1表達減少導致Wnt/β-catenin信號傳導增加[51]。高濃度的BMP-2能夠增加DKK1蛋白的表達，進而對Wnt/β-catenin信號通路進行負性調節(jié)[52]。由以上研究結果可知，Wnt/β-catenin與 BMP-2/Smads信號通路存在一種負性調節(jié)作用，應進一步加強雙信號通路在臨床用藥方面的研究，在藥物機理、濃度、時間等方面進行進一步深入探討，以期更好的靶向用藥。

4 展望

OP的形成是一個極其復雜的生物學過程，涉及多個基因與因素。Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號通路在骨形成和破壞的調節(jié)中起著重要作用，這些通路中涉及的信號因子可以作為治療OP的藥物靶點，用于進一步的深入研究。然而，隨著這些藥物的發(fā)展，還需要解決與作用模式相關的潛在問題，如骨形成過度導致的閉塞孔或通路減壓導致的假定致癌性。目前的研究表明，Wnt信號通路的非選擇性激活可能會導致副作用，甚至腫瘤的發(fā)生，例如大腸癌患者Dkk1表達顯著降低，這表明Wnt信號通路的激活可能與大腸癌有關，高濃度BMP2可能會增加骨膜衍生細胞中的細胞凋亡并減少細胞增殖[53]，因此靶向刺激Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號通路進行定位、定量、定時的骨質疏松靶標治療仍需進一步研究。繼續(xù)探索信號通路的Wnt/β-catenin和BMP-2/Smad之間的相互作用機制，并制定有效的特異性靶向激活劑或拮抗劑，這對OP藥物開發(fā)將會是一個顯著的影響，有望為OP治療開辟新的前景。