熊 姍，張海江，李 成 （1.中國科學院大學，北京 100049；2.中國科學院成都生物研究所，四川成都610041；.大自然保護協(xié)會，浙江 杭州 11118）

全球大約20%的陸棲脊椎動物面臨著多種威脅并經(jīng)歷著種群快速下降和物種滅絕，包括25%的哺乳類、13%的鳥類、22%的爬行類以及41%的兩棲類[1]。對我國兩棲類的評估發(fā)現(xiàn)我國兩棲類受威脅物種達到43.1%[2]。顯然，兩棲動物的生存境況極其嚴峻。監(jiān)測兩棲動物種群動態(tài)并確定其致危因素是應對危機的關鍵步驟[3]。為此，我國分別于2011年由生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所牽頭啟動了“兩棲類示范觀測項目”[4]；在2014年由中國科學院成都生物研究所牽頭組織了“中國關鍵地區(qū)兩棲爬行動物多樣性監(jiān)測與研究專項網(wǎng)”[5]。至此，我國的兩棲動物監(jiān)測有了規(guī)?；捏w系，但目前在監(jiān)測中還存在如下幾個問題沒有得到較好的解決：（1）兩棲動物分布不集中，在制定監(jiān)測方案時需布設多條樣線或樣方[6]，人工成本較高。（2）物種的種群數(shù)量在季節(jié)以及年度間波動較為顯著，氣候因素對觀測結果影響較大[7]，在制定監(jiān)測方案時需布置2～4個季節(jié)的調查[6]，時間成本高。（3）種群數(shù)量統(tǒng)計不準確，兩棲動物具有較強的季節(jié)遷徙習性，由于不能識別個體，只能采用平均個體發(fā)現(xiàn)率來代表種群數(shù)量。

被動集成應答器（passive integrated transponder，PIT）技術產生后，研究人員在1987年對于黑足鼬（Mustela nigripes）、蒙眼貂（（Mustela putorius furo）的研究中使用了PIT標記，證明了PIT標記對于實現(xiàn)個體識別的有效性[8]，隨后PIT標記被廣泛運用到野生動物的標記重捕研究中，包括哺乳類[9]、魚類[10]、鳥類[11]、爬行類[12]以及兩棲類[13]。FABER[14]首次采用PIT標記技術研究了高山歐螈（Triturus alpestris），雌螈重捕率為74.6%，雄螈重捕率為82.2%，表明PIT標記重捕法在兩棲動物研究中的適用性，開創(chuàng)了將PIT標記技術運用到兩棲動物研究中的先河。此后PIT標記重捕法廣泛運用于兩棲動物種群動態(tài)、遷移模式等研究中。

該文介紹了一種利用繁殖點調查法與PIT標記重捕法相結合，獲得短期兩棲動物重捕數(shù)據(jù)后，基于開放式種群標記重捕模型的調查與分析方法。以四川省平武縣老河溝自然保護區(qū)內的中華蟾蜍為代表物種，以5 d野外調查的標記重捕數(shù)據(jù)，準確快速地估算其種群數(shù)量。該方法提供了一種簡潔有效的種群數(shù)量調查方法，對于珍稀物種的評估具有較高的價值。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域

老河溝縣級保護區(qū)地處四川省平武縣東部，東側毗鄰四川省青川縣唐家河國家級自然保護區(qū)，北側與甘肅省文縣白水江國家級自然保護區(qū)相鄰，南部為平武縣高村鄉(xiāng)，西邊與木皮鄉(xiāng)、木座鄉(xiāng)接壤，地理坐標位為32°36'22″～32°25'52″N，104°32'42″～104°45'25″E。面積約 11 000 hm2。海拔 1 250～3 504 m，相對高差2 200 m左右，地形較復雜，平均坡度30°。該地屬于亞熱帶山地氣候，年均溫4～12℃，多年平均降水量950～1 300 mm。

1.2 研究對象

中華蟾蜍（Bufo gargarizans）隸屬于兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蟾蜍科（Bufonidae）、蟾蜍屬（Bufo），主要生活于海拔0～3 500 m的多種生態(tài)環(huán)境中。每年的3—5月，中華蟾蜍的卵產在臨時性、永久性靜水塘或流溪的洄水塘內。卵數(shù)多，卵徑小，發(fā)育迅速，從卵孵化到蝌蚪變態(tài)上陸僅需2～3個月，季節(jié)性的來水即可成功繁殖。蝌蚪為靜水型蝌蚪：數(shù)量多，個體小，尾較短，尾肌弱，越冬的蝌蚪極為少見。比較適合水溫變異幅度大，容易干涸并具有豐富食物的靜水環(huán)境。成體為陸棲生活類型：體肥壯，后肢粗短，蹠突特別發(fā)達，有游離刃，皮膚厚，富于腺體或具瘰粒，生活在土洞內或深埋在水底的泥沙內。中華蟾蜍體型較大，雄蟾體長63～90 mm，雌蟾體長85～116 mm，是我國分布最廣的兩棲動物物種，也是平原和低山丘陵的常見種[15]；在生活史的各個階段對環(huán)境的適應能力極強[16]。種群數(shù)量在繁殖期與非繁殖期波動較為顯著[17]；具有較強的季節(jié)性遷徙習性，無明顯的個體識別特征[18]。中華蟾蜍具有了兩棲動物調查3個難點的代表性和典型性。

1.3 研究方法

1.3.1 繁殖點調查法

由于兩棲動物是變溫動物，生理活動受到環(huán)境溫度的較大影響。多數(shù)的兩棲動物具有明顯的繁殖期和非繁殖期，需要周期性地聚集到特定的繁殖場所進行繁殖活動。藉此特點，在兩棲動物的繁殖季節(jié)，在特定的繁殖場所開展集中連續(xù)調查，即為繁殖點調查法[19]。在溫帶地區(qū)，兩棲動物的繁殖期主要集中在春天和初夏的幾周內；在干旱地區(qū)，繁殖期集中在短促的雨季；而少數(shù)熱帶地區(qū)的兩棲動物一年四季都有可能繁殖，繁殖期較不明顯。兩棲動物在繁殖期的自然聚集，克服了其在非繁殖期分布不集中的難點，因此，繁殖點調查法的效率很高。該法可以用來監(jiān)測物種種群水平的變化、區(qū)系組成在不同時期的變遷，以及個體生態(tài)學研究。

繁殖點調查法可以調查成體，也可以調查幼體。然而，幼體的密度受氣候和捕食者影響很大，在短期內也會出現(xiàn)很大的變化[20]；READING[21]標記了7 259只剛變態(tài)的幼體，僅有48只成年后回到出生的池塘繁殖；因此，幼體的密度并不能預測成體種群的大小。

在老河溝保護區(qū)，中華蟾蜍一般在3月開始進入水塘或河流緩流處繁殖，山區(qū)水塘集雨而成，干涸較快，卵和蝌蚪死亡很多。2013年在保護區(qū)內修建一處人工池塘（32.483 95°N，104.71 967°E，1 373 m），池塘呈梯形，面積為101.25 m2。池塘內引入山溪水，水位常年保持在20～30 cm。池內雜草叢生，雌雄抱對后共同移向合適的產卵地點，卵包裹在管狀的膠質卵帶內，纏繞在水池的水草上。蝌蚪孵化后主要攝食水池中的水草及落葉。由于面積大、常年有水、幼體食物豐富，吸引了大量的中華蟾蜍和中國林蛙（Rana chensinensis）等兩棲動物進入繁殖，因此該池塘成為保護區(qū)內重要的兩棲動物繁殖點之一。2014年3月12—16日，對該繁殖點的中華蟾蜍成體種群數(shù)量開展了短期調查。

圖1 中華蟾蜍的繁殖池塘Fig.1 Breeding ponds of Bufo gargarizans

1.3.2 PIT標記重捕法

兩棲動物的多數(shù)成體在繁殖期間只有較短時間會在繁殖場出現(xiàn)[22-23]。要準確地評估物種的種群數(shù)量，則需要采用標記重捕法進行調查。傳統(tǒng)的兩棲動物標記多為損傷性的個體識別技術，如剪指（趾）、烙印、植入性熒光標記、趾環(huán)、彩漆、色斑等[24-27]。BROWN[28]探究了 PIT 標記對兩棲動物的影響，結果表明，PIT標記對于兩棲動物個體的存活率及身體狀況的負面影響可忽略不計。此后，該方法被廣泛應用于兩棲動物監(jiān)測和研究，是實現(xiàn)兩棲動物標記和個體識別的最佳方法[29]。

PIT標簽是一種體積小的玻璃封裝的微型芯片，尺寸僅有1.4 mm×8.4 mm，質量為0.06 g。每個標簽有唯一的編號，通過將標簽注射進動物體內，實現(xiàn)對動物的個體識別，通過多次重捕，快速準確地評估野生兩棲動物的種群數(shù)量。PIT標記重捕法和繁殖點調查法相結合[30]，可以大幅提高傳統(tǒng)監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確率。

2014年3月12日20點開始，工作人員捕捉進入繁殖場的中華蟾蜍；記錄中華蟾蜍的性別、抱對情況、測量頭體長、體重、將PIT標簽用注射器注射到胯部皮膚與肌肉之間，用醫(yī)用膠水封閉注射孔，防止電子標簽掉落；同時，由于PIT標簽有丟失的情況[31-32]，為了正確估算標簽丟失率，研究中需要采用2種獨立的標記方法進行標記[33]，所以該研究采用PIT為主要標記和剪趾法輔助的綜合標記方法，用醫(yī)用酒精消毒后剪取每只成體最長的第4趾的一節(jié)趾骨作為輔助標記，剪趾后使用液體創(chuàng)可貼；全部標記后統(tǒng)一釋放回繁殖場。其后的4晚重復相同的工作；運用掃描儀掃描所有個體的PIT編號，記錄已標記個體的PIT編號，對未標記的個體注射PIT標簽進行標記。

標記重捕法的準確性主要取決于樣本量，當重捕幾率小時樣本量要大于200[34]；該次調查共用PIT標記了212只中華蟾蜍。在5 d的調查期間，僅有1枚標簽脫落（表1）。

表1 中華蟾蜍的標記重捕資料Table1 Capture-Mark-RecapturedataofBufogargarizans

1.3.3 分析方法

等捕性檢驗：個體間具等捕性是標記重捕模型估算種群參數(shù)的前提條件。所有的標記重捕模型都是基于以下假設：個體抽樣是完全隨機的，標記個體與未標記個體有著相同的捕獲概率。如果種群個體間不具等捕性，則應用模型估算的種群參數(shù)均不可靠[35-36]。因此，應用標記重捕模型分析前首先采用Leslie法對中華蟾蜍個體等捕性進行檢驗[35]。如再捕獲數(shù)與再捕獲期望值差異顯著即表明個體間不具等捕性。

模型選擇：經(jīng)檢驗，中華蟾蜍個體間滿足等捕性條件后，采用R軟件（R Core Team 2017）中的RMark包[37]，對中華蟾蜍標記重捕資料進行分析。RMark包提供了100余個利用標記重捕資料估算種群參數(shù)的模型[38]。

中華蟾蜍在繁殖期不斷地有新的個體進入繁殖場，同時也有個體離開繁殖場，屬開放式種群。因此，選擇適用于開放式種群的Jolly-Seber模型[39-40]。Jolly-Seber模型有很多適用于短期或長期標記重捕資料的子模型，POPAN模型是Jolly-Seber模型中的一個子模型[41-42]，適用于基于連續(xù)的標記重捕資料，估算個體進入繁殖場的遷入率（t）、遷出率（1-φ）、存活率（φ）、重捕率（p）、每晚種群數(shù)量（N）、種群總數(shù)（NGross）。MADSEN 等[42]在 1987—1991年采用繁殖點調查法對大蟾蜍（Bufo bufo）進行了剪趾標記重捕，運用POPAN模型分別估計了每年的種群數(shù)量。該文擬采用該模型適于短期標記重捕資料的計算優(yōu)勢，估算中華蟾蜍繁殖種群數(shù)量。

模型結果評估：目前最優(yōu)的方法是通過比較赤池信息準則（akaike information criterion，AICc）[43]和權重（AICc weight）選擇對數(shù)據(jù)支持度最高的模型；其次，△AICc為該模型與所有候選模型中最小的AICc值之間的差值，△AICc越小，模型越好。當其他模型△AICc＜2時需要對所有△AICc＜2的模型計算結果進行模型平均[44]。

2 研究結果

2.1 捕獲量和標記量

2014年3月12—16日，每晚捕獲量為40～64只，共標記了212只中華蟾蜍個體，重捕45次，新標記個體數(shù)隨著總標記個體數(shù)的增加逐漸減少（表1）。平均重捕率22.5%，重捕率最低為12.0%，最高為31.7%（表2）。

表2 各取樣期的重捕率Table 2 Recaptures of the toads PIT tagged in the date

2.2 中華蟾蜍等捕性

利用Leslie法對中華蟾蜍個體等捕性進行檢驗，即以取樣時點i前個體的被捕獲次數(shù)（j=0，1，2，…），把在該時點捕獲釋放的Si只個體分組，然后利用卡方檢驗（χ2-test）比較i+1時點上述各組的再捕獲數(shù)（b）與其期望值（E）的差異，差異顯著即表明調查種群個體不具等捕性，差異不顯著則表明調查種群個體具等捕性。Leslie法對中華蟾蜍個體等捕性檢驗結果表明，在各取樣期不同捕獲次數(shù)的個體再捕率均無顯著差異（χ2=0.79，χ2＜χ0.052=14.07，自由度d?=7，P＞0.05），表明中華蟾蜍個體間具等捕性，可滿足標記重捕模型估算種群參數(shù)的前提條件。

2.3 中華蟾蜍種群數(shù)量

遷入率（t）、存活率（φ）、重捕率（p）是利用POPAN模型計算種群數(shù)量的3個重要參數(shù)，將3個參數(shù)分別定義為常數(shù)值（～1）或隨時間變動的值（～time），共產生8個隨機模型，然后用標記重捕數(shù)據(jù)分別進行擬合。擬合結果顯示，在8個隨機模型中，φ和p為常數(shù)、遷入率隨時間變化的模型2的AICc值最低，權重值為0.52，為最優(yōu)模型；其次是模型1，其△AICc值為1.87（表3）。由于2個模型的△AICc＜2，需對2個的模型計算結果進行平均，則中華蟾蜍每晚在繁殖場的種群數(shù)量為252～377只，繁殖種群總數(shù)為（641±86）只（表4）。

3 討論

3.1 蟾蜍的適應能力和瀕?，F(xiàn)狀

全球兩棲動物共有7 968種，其中蟾蜍科有617種（www.amphibaweb.org），是全世界分布最廣的科級兩棲動物，占據(jù)著多種不同的棲息地。VAN BOCXLAER等[45]對蟾蜍科的進化史進行了重構，發(fā)現(xiàn)7個性狀推動了蟾蜍的全球擴張。7個性狀包括：（1）適應缺水的環(huán)境；（2）有毒腺，防止被捕食；（3）體內存儲了大量脂肪，能量足；（4）個體相對較大，體表面積比值小，失水少；（5）繁殖場所靈活多樣；（6）卵的數(shù)量大；（7）蝌蚪屬外部營養(yǎng)型，自主覓食，不需要母親提供能量。大多數(shù)原始蟾蜍都有這些特性，從而使該群體擁有了擴大分布區(qū)的能力。

蟾蜍雖然具有強大的擴散和適應能力，然而其生存狀況卻不容樂觀。對全球5 743種兩棲動物的評估結果顯示[46]，32.5%（1 856種）的兩棲動物受到滅絕威脅；而在評估的461種蟾蜍科物種中，45.6%的蟾蜍受到滅絕威脅。中國的蟾蜍科共20種，7種（35.0%）受到滅絕威脅[2]。

中華蟾蜍是我國分布最廣的兩棲動物，數(shù)量大，食性廣，是農田和森林里最重要的生態(tài)益蟲之一[47]。由于其分布面積大、數(shù)量多、遷移能力強，只能通過繁殖期的集中調查評估其種群數(shù)量；而在非繁殖期，由于中華蟾蜍長距離的遷徙、分散覓食，調查難度非常大。通過對中華蟾蜍繁殖期的種群數(shù) 量評估對于其他兩棲動物調查也有啟示意義。

表3POPAN模型篩選結果Table 3 Model selection results from the POPAN model

表4 基于POPAN模型的中華蟾蜍種群數(shù)量Table 4 Population size estimates from the POPAN model

3.2 復合型調查方法的優(yōu)勢和不足

監(jiān)測方法對監(jiān)測指標和數(shù)據(jù)質量具有重要影響。通常兩棲動物監(jiān)測中使用的監(jiān)測方法有樣線法、樣方法、圍欄陷阱法等[5-6]。以物種多樣性監(jiān)測為例，對佛羅里達州的22種兩棲類進行了調查方法比較[48]，結果發(fā)現(xiàn)：遇見法發(fā)現(xiàn)12種，樣方法發(fā)現(xiàn)6種，圍欄陷阱法發(fā)現(xiàn)7種。

以種群密度和動態(tài)監(jiān)測為例，在研究卵齒蟾屬（Eleutherodactylus）種群密度和種群動態(tài)時發(fā)現(xiàn)[34]：遇見法與樣線法得到的種群密度較低，而且對種群動態(tài)的預測結果偏差大；標記重捕法得到的種群密度也較低，但對種群動態(tài)的預測結果較準確。遇見法的預測準確率為0.10～0.52，樣線法是0.27，標記重捕法的預測準確率為0.35～0.61。研究表明，標記重捕法的評估結果更精確，偏差更小，而且能夠及時有效地監(jiān)測種群數(shù)量和動態(tài)[49]。

物種的種群數(shù)量和動態(tài)是確定瀕危等級，制定保護物種名錄的重要依據(jù)[50]。謝鋒[51]采用繁殖點調查法和標記重捕法調查了國家二級保護動物鎮(zhèn)海棘螈（Echinotriton chinhaiensis）的種群數(shù)量。繁殖點調查法發(fā)現(xiàn)1997、1998和1999年雌性個體總數(shù)分別是50、88、89只；對發(fā)現(xiàn)的部分個體剪指（趾）標記，1997、1998和1999年分別剪指（趾）標記了31、53、54只，重捕后經(jīng)Petersen估計模式推算，1998年的雌性種群數(shù)量為（156±30）只，1999年的雌性種群數(shù)量為（181±11）只。正是基于對鎮(zhèn)海棘螈種群數(shù)量的準確評估結果，2000年國家林業(yè)局啟動了鎮(zhèn)海棘螈保護小區(qū)的規(guī)劃和建設，為我國的瀕危物種保護建立了科學示范。

通過標記來實現(xiàn)個體識別，通過多次重捕以提高預測準確率，標記重捕法是一種較好的物種多樣性和種群動態(tài)監(jiān)測方法[52]。謝鋒等[53]特別指出，每種監(jiān)測方法的適用類群不同，監(jiān)測指標各異，在野外工作中同時采用2～3種方法可以更好地監(jiān)測物種多樣性和種群的變化。在標記重捕研究中，應用PIT標記有以下優(yōu)點：（1）保留率高：監(jiān)測期間，僅有一個個體標簽脫落；（2）識別精確：標簽編號具有唯一性，不會出現(xiàn)誤讀的情況，而剪指（趾）法、烙印等標記隨著標記時間的增加而錯誤識別的幾率也會增加；（3）負擔?。弘娮訕撕炛亓績H0.06 g；（4）使用壽命長，適用于中長期標記重捕研究。但PIT標記在對兩棲動物標記時有著以下局限：（1）標簽會在動物體內移動，可能會導致誤認為標簽丟失；（2）不適用于體型過小的兩棲動物（體重小于2 g）[54]，尤其是兩棲動物幼體[29]。

繁殖點調查法與標記重捕法相結合的復合型調查方法有如下優(yōu)點：繁殖點調查法利用了兩棲動物集群繁殖的生物學習性，克服了個體分布不集中的難點，捕捉難度小，人工成本低；在較短的、較固定的繁殖期進行調查，以繁殖種群為調查對象，減小了不同季節(jié)的種群數(shù)量的波動，調查時間也大大縮短；PIT標記實現(xiàn)了個體識別，對動物個體的傷害較小，可以得到較長期和較準確的種群動態(tài)數(shù)據(jù)，以及生長、運動遷移、健康狀況等信息。該方法適用于在臨時性的池塘、或者永久性的池塘、或溪流中的兩棲動物的繁殖種群調查；尤其對于繁殖期明顯，短期內聚集，爆發(fā)式繁殖的廣布種非常有效；對于狹域分布的、數(shù)量較少的珍稀物種的快速評估也具有很高的價值。

該復合型調查方法不能準確監(jiān)測的情況如下：（1）繁殖期較不明顯的物種，如熱帶地區(qū)一年內多次繁殖的物種；（2）繁殖點較分散的物種，如水樹蛙屬（Aquixalus）的物種；（3）個體太小不能攜帶PIT標簽的物種，如水蛙屬（Hylarana）、浮蛙屬（Occidozy?ga）、姬蛙屬（Microhyla）、水樹蛙屬（Aquixalus）、纖樹蛙屬（Gracixalus）的物種。

3.3 POPAN模型用于種群數(shù)量分析的優(yōu)越性

目前，常用的標記重捕模型有Lincoln-Index模型、Jolly-Seber模型、POPAN模型、Robust Design模型等。Lincoln-Index模型是最簡單的標記重捕模型，只需要一次標記、一次重捕所獲得的數(shù)據(jù)就可以估計種群數(shù)量，但只適用于無出生、死亡、遷入、遷出個體的封閉式種群，并且所獲得的結果誤差較大[55]。而野外種群大多是開放式種群，Jolly-Seber法被認為是研究開放式種群最好的方法之一[56]。POPAN模型就是屬于Jolly-Seber法的一個模型，能夠基于≥4 d的標記重捕數(shù)據(jù)估算種群數(shù)量等參數(shù)；而Jolly-Seber模型的其余子模型僅能估算存活率、遷入率等參數(shù)，無法估算種群大小。Robust Design模型則結合了開放式種群和封閉式種群的特點，但在估算種群數(shù)量等參數(shù)時需要重捕周期發(fā)生在不同時間尺度（年、月、日）上，每一次重捕周期內有≥2次重捕[57-59]。因此，在重捕周期僅有一個時間尺度上的情況下，要獲得種群數(shù)量等參數(shù)時，POPAN模型是最適用的標記重捕模型。

CITTA 等[40]在研究白鯨（Delphinapterus leucas）的種群動態(tài)時，模擬了不同遷移率水平下的標記重捕數(shù)據(jù)，然后運用這些數(shù)據(jù)跟POPAN模型進行了擬合。結果表明，POPAN模型所估算的種群數(shù)量結果95%的置信區(qū)間都包含了模擬的種群數(shù)量，表明POPAN模型適用于標記重捕數(shù)據(jù)，擬合的結果較為準確。但在該研究中，采用的是遺傳標記，重捕時出現(xiàn)了識別模糊的情況，對種群數(shù)量估算有一定的影響。而這次對中華蟾蜍采用了PIT和剪趾的復合標記方法，標記的212只個體在5 d的重捕周期中僅有一個個體出現(xiàn)標簽丟失的情況；并且每個PIT標簽都有唯一的電子編號，沒有識別錯誤；因此，運用POPAN模型對中華蟾蜍種群數(shù)量的估算結果因PIT標記實現(xiàn)了對個體的準確識別，對中華蟾蜍種群數(shù)量的估算更準確。

致謝：四川省平武縣老河溝保護區(qū)的陳祥輝、蔡興貴、舒成、張海江、強國權、胡小梅、向遵忠、杜惠、吳紅等協(xié)助調查工作，中國科學院成都生物研究所陳有華研究員指導模型選擇和分析，Janak Raj Khatiwada博士校訂英文摘要，特此致謝。