吳相佚，劉澤朋，毛學(xué)英*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

牛乳蛋白質(zhì)中含有人體所需的氨基酸，在生長發(fā)育中起著重要作用[1-2]，且蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)[3]。近年來，通過物理或化學(xué)方法對(duì)牛乳蛋白質(zhì)進(jìn)行改性是研究熱點(diǎn)，即通過酶解或物理方法（如熱處理、超高壓和超聲波等）使氨基酸和多肽鏈發(fā)生變化，從而引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的變化，改性后的蛋白質(zhì)功能特性和營養(yǎng)特性得到改善[4]。因此，尋找一種適當(dāng)?shù)奶幚矸椒▽?duì)牛乳進(jìn)行加工，提高牛乳的營養(yǎng)特性備受關(guān)注。

蛋白質(zhì)的物理改性是指利用熱、超高壓、超聲波等物理作用形式來對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，物理改性會(huì)改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間聚集方式，但通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)[5]。近年來，熱處理已經(jīng)成為一種常用的物理改性方法。王婷婷等[6]對(duì)牦牛乳進(jìn)行熱處理后發(fā)現(xiàn)，熱處理會(huì)引起牛乳體系濁度和粒徑的增加。除此之外，研究表明，熱處理會(huì)對(duì)乳蛋白的消化性產(chǎn)生一定影響[7]。因此，本研究通過對(duì)乳蛋白進(jìn)行熱處理，研究熱處理后乳蛋白結(jié)構(gòu)及消化特性的變化，對(duì)提高乳蛋白消化特性的進(jìn)一步研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮乳蛋白70（milk protein concentrate，MPC70）、胰蛋白酶（Trypsin 1∶250）、胃蛋白酶（Pepsin 1∶10 000）美國Sigma公司；丙烯酰胺（acrylamide，AM）、甲叉丙烯酰胺（bis-acrylamide，BIS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl） methyl aminonethane，Tris）、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、N,N,N,N’-四甲基乙二胺（N,N,N,N’-tetramathylethylenediamine，TEMED）美國Amresco公司；無水乙醇、冰乙酸、無水甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興生物技術(shù)有限公司；MDF-C8V1醫(yī)用低溫箱 松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器北京博宇寶威實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；DHG-9030電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；電泳槽、iMark酶標(biāo)儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；RF-6000熒光分光光度計(jì)島津集團(tuán)（香港）有限公司；MOS-500圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

稱取適量MPC70，用去離子水配制成40 mg/mL的乳液，磁力攪拌2 h使其充分溶解。分別在25、75、85、95 ℃加熱15 min，冷卻至室溫，取樣調(diào)節(jié)pH值至7.0后冷凍干燥。

1.3.2 表面巰基含量的測定

采用Ellman’s 5,5’-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）法測定不同處理后MPC70溶液的表面巰基含量[8]。稱取適量MPC70凍干樣品，溶于蒸餾水配制為質(zhì)量濃度2 mg/mL的溶液；吸取1 mL蛋白溶液，順序加入4.0 mL Tris-甘氨酸（Gly）緩沖液Ⅰ和50 μL Ellman’s試劑，混合均勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)15 min；反應(yīng)后于412 nm波長處測其吸光度。表面巰基含量按下式計(jì)算。

式中：A412nm為樣品在412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

Ellman’s試劑配制：稱取0.2 g DTNB，溶于50 mL Tris-Gly緩沖液Ⅰ，4 ℃避光保存。

（六）生化試驗(yàn) 取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物，分別接種于蔗糖、山梨醇、葡萄糖、甘露糖、乳糖、馬尿酸鈉及淀粉培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察其對(duì)糖的利用情況，全部重復(fù)三次，并記錄結(jié)果見表1。

1.3.3 表面疏水性的測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-a n i l i n i o-1-naphthlenesulfonic acid，ANS）熒光探針法[6]測定熱處理后MPC70表面疏水性的變化。用0.01 mol/L pH 7.4 PBS將熱處理后的蛋白樣品稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液，取2 mL蛋白稀釋溶液與10 μL 8 mmol/L的ANS溶液混合均勻，測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，曲線初始段的斜率為表面疏水性。

1.3.4 圓二色光譜的測定

稱取適量MPC70凍干粉，溶于蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的待測樣品溶液。設(shè)置圓二色光譜儀掃描范圍為遠(yuǎn)紫外區(qū)190～250 nm。以蒸餾水為空白，圓二色譜圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白消除后進(jìn)行擬合[9]。

1.3.5 MPC70的酶解及體外模擬胃腸消化

取熱處理MPC70凍干粉，采用兩步法模擬胃腸消化，步驟如下：1）取熱處理后樣品，調(diào)節(jié)pH值至2.0，按照酶與底物質(zhì)量比為1∶50加入胃蛋白酶，于37 ℃恒溫振蕩器酶解2 h，取樣待用；2）取胃蛋白酶酶解2 h樣品，調(diào)節(jié)pH值至7.5，按照酶與底物質(zhì)量比為1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃恒溫振蕩酶解2 h，取樣待用。

調(diào)節(jié)MPC70胃消化液和胃腸消化液pH值至7.0后冷凍干燥。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

非還原型上樣緩沖液的配制：量取1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）3 mL，加入25 mL 50%甘油、10 mL 10% SDS及5 mL 1%溴酚藍(lán)，加入去離子水定容至50 mL，振蕩至充分溶解；還原型上樣緩沖液的配制：量取1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8）3 mL，加入25 mL 50%甘油、10 mL SDS固體粉末、5 mL 1%溴酚藍(lán)及2.5 mLβ-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）后，加入去離子水定容至50 mL，振蕩至充分溶解。

稱取凍干后樣品，用去離子水配制成質(zhì)量濃度40 μg/μL的溶液，振蕩使其充分溶解，加入上樣緩沖液將樣品稀釋至4 μg/μL，振蕩使其充分混合后于100 ℃水浴鍋內(nèi)加熱5 min，取出冷卻至室溫。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，堆積膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。膠孔中加入5 μL樣品，使蛋白上樣量為20 μg，調(diào)節(jié)電壓為90 V，待Marker條帶分開，調(diào)節(jié)電壓為110 V。電泳結(jié)束后加入考馬斯亮藍(lán)染色2～4 h，加入脫色劑脫色12 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析時(shí)，使用單因素方差分析（One Way ANOVA）伴隨Duncan’s多重比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)MPC70蛋白組成的影響

圖1 MPC70經(jīng)不同熱處理后的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 Analysis of SDS-PAGE of MPC70 after different heat treatments

由圖1可知，各樣品主要包含αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白5 個(gè)條帶。泳道1～4為非還原型電泳，如泳道1～4所示，經(jīng)過熱處理后，乳清蛋白的變化較明顯。與25 ℃熱處理樣品相比，隨著熱處理溫度的升高，β-乳球蛋白條帶逐漸變淺，當(dāng)熱處理溫度達(dá)到95 ℃時(shí)，其條帶最淺。當(dāng)熱處理溫度達(dá)到85 ℃時(shí)，α-乳白蛋白條帶明顯變淺。而熱處理后的酪蛋白條帶幾乎沒有明顯變化，表明酪蛋白的含量并未降低，這與酪蛋白的熱穩(wěn)定性有關(guān)。還原型電泳是在上樣緩沖液中加入β-ME，其作為強(qiáng)還原劑能夠斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵[10]。通過比較還原型電泳和非還原型電泳泳道可知，非還原型電泳（泳道1～4）膠孔出現(xiàn)聚集物，而還原型電泳（泳道5～8）聚集物消失，即經(jīng)過熱處理后減少的乳清蛋白形成了聚合物。同時(shí)，添加β-ME后聚合物消失，表明乳清蛋白聚合物之間通過二硫鍵結(jié)合而成。研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定，在加熱過程中會(huì)與酪蛋白發(fā)生聚合[11]。在加熱條件下，β-乳球蛋白也會(huì)發(fā)生變性聚合，溫度升高會(huì)引起變性程度更大的聚合物形成[12]。到達(dá)85 ℃時(shí)，α-乳白蛋白也會(huì)發(fā)生變性，與β-乳球蛋白聚合物形成復(fù)合體[13-14]。

2.2 熱處理對(duì)MPC70表面巰基含量的影響

由圖2可知，樣品經(jīng)過75 ℃熱處理15 min后，其表面巰基含量與25 ℃處理組相比沒有顯著變化。與25 ℃處理樣品相比，當(dāng)熱處理溫度達(dá)到85、95 ℃時(shí)，MPC70的表面巰基含量顯著升高。巰基是蛋白質(zhì)分子中重要的功能性基團(tuán)，通過形成二硫鍵維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而影響蛋白質(zhì)的功能特性[15]。乳蛋白中巰基基本位于β-乳球蛋白上，當(dāng)溫度高于85 ℃時(shí)，β-乳球蛋白會(huì)發(fā)生熱變性，暴露出內(nèi)部隱藏的巰基，從而導(dǎo)致表面巰基含量增加[16]。

2.3 熱處理對(duì)MPC70表面疏水性的影響

圖3 不同熱處理對(duì)MPC70表面疏水性的影響Fig. 3 Effects of different heat treatments on the surface hydrophobicity of MPC70

由圖3可知，MPC70經(jīng)過熱處理后其表面疏水性顯著上升，當(dāng)熱處理溫度達(dá)到95 ℃時(shí)，表面疏水性最高。疏水相互作用在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中起著主要作用，對(duì)蛋白質(zhì)氫鍵和靜電引力有促進(jìn)作用。一定程度的熱處理會(huì)使蛋白質(zhì)的多肽鏈展開，暴露出活性基團(tuán)，從而使蛋白質(zhì)的表面疏水性上升?；钚曰鶊F(tuán)的暴露也會(huì)使蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)暴露，引起消化性的升高[6]。

2.4 熱處理對(duì)MPC70二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表1 熱處理強(qiáng)度對(duì)MPC70二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的影響Table 1 Effects of heat treatment on the secondary structure of MPC70

由表1可知，MPC70經(jīng)過熱處理后，α-螺旋含量降低，經(jīng)過95 ℃處理15 min后，其含量顯著降低至4.4%。隨著熱處理溫度的升高，β-折疊含量呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，而β-轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢。無規(guī)則卷曲呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢，且95 ℃處理15 min的樣品無規(guī)則卷曲含量多于對(duì)照組。

熱處理過程中，乳蛋白發(fā)生變性，存在于蛋白質(zhì)折疊區(qū)的β-折疊含量升高，當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，α-乳白蛋白發(fā)生變性，與β-乳球蛋白聚集，導(dǎo)致β-折疊含量減少[17]。二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是由于蛋白質(zhì)分子外部環(huán)境的變化，且這種改變并不是產(chǎn)生新的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而是已存在的結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象改變和折疊[18]。無規(guī)則卷曲含量增多表明熱處理引起的乳蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)改變使乳蛋白結(jié)構(gòu)的隨機(jī)性增強(qiáng)，有序結(jié)構(gòu)逐漸向無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[19]。

2.5 熱處理對(duì)MPC70消化性的影響

圖4 熱處理MPC70體外模擬消化過程SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Analysis of SDS-PAGE of digested MPC70 after being heated at 25 and 95℃

由圖4可知：胃消化后總蛋白含量明顯減少（泳道2、5），25 ℃處理組的酪蛋白條帶比95 ℃處理組樣品淺，表明95 ℃處理樣品的酪蛋白在胃消化中消化程度降低；胃消化后β-乳球蛋白和α-乳白蛋白條帶顏色較深，這表明在此階段乳清蛋白消化程度不高。經(jīng)過腸消化后（泳道3、6），25 ℃與95 ℃處理樣品酪蛋白條帶消失，表明酪蛋白消化程度較高；同時(shí)，95 ℃處理樣品經(jīng)過腸消化后，其乳清蛋白條帶比25 ℃處理樣品淺，表明經(jīng)過95 ℃處理提高了乳清蛋白的消化率。何光華等[20]發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理溫度的升高，乳清蛋白的消化速率顯著升高，表明熱處理提高了乳清蛋白的消化率。Florence等[21]發(fā)現(xiàn)，未加熱脫脂乳中的酪蛋白和β-乳球蛋白對(duì)胃消化有較高的抗性，而加熱后β-乳球蛋白對(duì)胃消化較敏感。黃俊等[22]將乳清蛋白分別在75、100 ℃濕熱處理后模擬體外消化，發(fā)現(xiàn)100 ℃加熱后乳清蛋白的消化率升高。這可能是由于一定程度的熱處理能夠使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松散，促使分子內(nèi)部的側(cè)鏈活性基團(tuán)暴露出來，因此更易被蛋白酶水解。

3 結(jié) 論

熱處理改變了MPC70中乳蛋白的表面巰基含量和表面疏水性。在熱處理過程中，當(dāng)處理溫度高于75 ℃時(shí)，乳蛋白的表面巰基含量顯著升高，在95 ℃時(shí)達(dá)到最高值42.4 μmol/L。表面疏水性也隨著熱處理溫度的升高而升高，同樣在95 ℃時(shí)達(dá)到最高值。熱處理改變了MPC70中乳蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。MPC70經(jīng)過熱處理后，α-螺旋含量降低，β-折疊含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而β-轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，無規(guī)則卷曲含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且在95 ℃時(shí)高于對(duì)照組。熱處理明顯改變了MPC70中乳蛋白的消化性，經(jīng)過95 ℃熱處理的乳蛋白在胃消化過程中消化性降低，但腸消化后蛋白條帶明顯變淺，消化性升高，這與其結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。