羅 岸，左紫怡，焦 雄，劉 夏

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

合子是被子植物生長發(fā)育的起點，對其研究具有重要的科學(xué)意義。煙草Nicotiana tabacum合子和胚胎細胞的發(fā)育模式較為規(guī)范，一直被當(dāng)作研究被子植物胚胎發(fā)生的模式植物。在煙草中，精卵結(jié)合形成合子后會經(jīng)過一段時間的休眠，緊接著發(fā)生一系列形態(tài)變化，比如體積相比卵細胞有所縮小、大液泡逐漸消失、細胞核移動到細胞中央等。之后隨著合子完成極性伸長變成長形合子，細胞核移動到合子的合點端，合子進入分裂周期并啟動后續(xù)的胚胎發(fā)育[1]。以上過程伴隨著一系列精確的分子調(diào)控，其中仍有很多問題不甚清楚。

作者在前期工作中制作了煙草長形合子和卵細胞的cDNA 文庫，并且通過差減分析獲得大量在合子中特異表達的基因。本研究以其中一個新型基因NtZE1的EST 序列為基礎(chǔ)，獲得其完整的編碼序列(Coding Sequence，CDS)和5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)，并對該基因編碼的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進行分析，對其5’側(cè)翼序列啟動基因表達的活性進行驗證，為后續(xù)基因功能分析等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物科技發(fā)展有限公司，實驗所需質(zhì)粒由武漢大學(xué)彭雄波副教授贈予。

1.1.2植物材料煙草Nicotiana tabacum紅花品種SR1、小葉煙草N.benthamiana種植于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院溫室中，溫室條件為恒溫25 ℃，光暗周期16 h/8 h。

1.1.3主要試劑EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒、EasyPure PCR Purification Kit試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq酶、Ex Taq酶、PrimeSTAR@GXL高保真酶、T4 DNA Ligase購自TaKaRa公司；Universal Genome Walker Kit試劑盒購自Clontech公司；Dynabeads?mRNA DIRECT? Micro Kit試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1煙草基因組文庫獲得和NtZE1基因5’側(cè)翼區(qū)克隆取煙草幼葉按照CTAB 法制得基因組，將其按照Universal Genome Walker Kit 試劑盒的要求進行處理，獲得合格的基因組文庫。用于克隆的GSP引物、反應(yīng)條件和體系按照試劑盒的要求設(shè)置。擴增得到的目的片段測序后進行序列拼接和延伸。全長檢測引物Pro-F：TGGGTTGATACTTGATGGTTTTGG；Pro-R：GGTTGTATTTTCTTTTTCCTTTTTC TATT。

1.2.2煙草長形合子cDNA的獲得和NtZE1基因編碼序列驗證應(yīng)用傳統(tǒng)的酶解-研磨法分離煙草長形合子[2—3]，收集約50個合子用于后續(xù)操作。按照Dynabeads? mRNA DIRECT? Micro Kit試劑盒的說明分離出長形合子mRNA，并使用SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing試劑盒制成長形合子cDNA。以煙草長形合子cDNA為模板，用引物CDS-F1/CDS-R1擴增NtZE1基因的CDS序列，CDS-F：ATGAATCTCAAAAGGGTGTTTGTAT；CDS-R：TTAATTTCCAAGTTTTTTCGACTTGT。

1.2.3NtZE1基因啟動子的EGFP核定位表達載體構(gòu)建根據(jù)序列信息設(shè)計NtZE1基因5’側(cè)翼區(qū)擴增引物，并在引物5’端添加合適的酶切位點用于基因克隆。以煙草基因組為模板擴增NtZE1基因的5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)。擴增產(chǎn)物膠回收后進行雙酶切，相應(yīng)的酶切產(chǎn)物純化后連接到核定位表達載體。

1.2.4NtZE1基因啟動子活性檢測構(gòu)建NtZE1基因啟動子的EGFP 核定位表達載體。利用瞬時表達技術(shù)將上述載體注入小葉煙草葉表皮細胞，48 h 后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5生物信息學(xué)分析用Omega 軟件分析基因序列中的開放閱讀框；用ProtParam、ProtScale 等在線軟件分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(包括疏水性和不穩(wěn)定性等理化性質(zhì))；用SOPMA、SWISS-MODEL 等在線軟件分析蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)；用PSORT、BaCelLo、SignalP 等在線軟件分析蛋白質(zhì)信號肽的存在和蛋白質(zhì)在亞細胞中的定位；用PLACE 和PlantCARE 等在線軟件分析啟動子序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草合子的分離

圖1 顯示，利用酶解和顯微操作分離得到的處于不同發(fā)育階段的合子大小形狀和生活狀態(tài)均屬正常。因此，按此方法可保證收集到數(shù)量足夠、質(zhì)量合格、時期準確的長形合子，用于制備其cDNA 作為基因克隆的模板。

圖1 煙草不同發(fā)育階段的合子的分離Fig.1 Isolation of zygote from different developmental stages in tobacco

2.2 煙草NtZE1 基因的克隆

通過差減分析前期獲得的煙草長形合子和卵細胞的cDNA 文庫，獲得長度為600 bp 的NtZE1基因EST 序列。經(jīng)Omega 軟件分析發(fā)現(xiàn)其具有一個315 bp 開放閱讀框(圖2: A)。以重新收集的長形合子細胞制作的cDNA 為模板，可以擴增到該基因的CDS 序列，證實NtZE1基因參與了合子時期的發(fā)育事件(圖2: B)。此外，利用NCBI 數(shù)據(jù)分析NtZE1基因的CDS 序列和編碼氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)除在絨毛狀煙草N.tomentosiformis中有一條較為類似的序列外，尚未在其他物種中發(fā)現(xiàn)類似序列，說明NtZE1基因可能是在合子生長發(fā)育中行使未知功能的新型基因。利用已知的EST 序列為基礎(chǔ)，運用Genome walking技術(shù)進一步獲取NtZE1基因5’側(cè)翼序列2578 bp(包括啟動子區(qū)和5’UTR 區(qū))(圖2: B)。

2.3 NtZE1 蛋白基本理化性質(zhì)

使用ProtParam 在線軟件對NtZE1蛋白進行分析。結(jié)果表明，該蛋白由105 個氨基酸殘基組成，分子量為12.0522 kDa。在105 個氨基酸殘基中共包含19 種基本氨基酸類型，但缺少色氨酸，且在所有氨基酸中半胱氨酸和賴氨酸的比例最高，各占10.5%。針對氨基酸殘基性質(zhì)的分析表明，NtZE1蛋白擁有14 個正電荷殘基和11 個負電荷殘基。NtZE1蛋白的理論等電點為8.28，屬于堿性蛋白。該蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為70.57，不穩(wěn)定性指數(shù)為49.10，平均總疏水性為-0.023。因此，NtZE1蛋白應(yīng)為親水性蛋白，且不太穩(wěn)定(表1)。

2.4 NtZE1 蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SOPMA 在線軟件對NtZE1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，顯示α-螺旋占69.52%，延伸鏈占3.81%，β-轉(zhuǎn)角占3.81%，無規(guī)則卷曲占22.86%(表2)。圖3 顯示，α-螺旋在NtZE1蛋白中含量最多，分布最為廣泛，而無規(guī)則卷曲主要分布在蛋白中部和C 端。這與使用SWISS-MODEL 服務(wù)器預(yù)測的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)基本吻合(圖4)。

圖2 煙草NtZE1 基因的克隆Fig.2 Cloning of NtZE1 in tobacco

表1 NtZE1 蛋白基本理化性質(zhì)的分析Table 1 Basic physicochemical properties analysis of NtZE1 protein

2.5 NtZE1 蛋白亞細胞定位及信號肽序列

利用ProtScale 在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)位于NtZE1蛋白N 端的氨基酸可能具有較高的疏水性。進一步使用SignalP 軟件分析，發(fā)現(xiàn)在NtZE1蛋白N端存在信號肽，且其剪切位點位于第23 和24 個氨基酸之間(圖5)。這與預(yù)測的NtZE1蛋白的亞細胞定位較為一致，PSORT、BaCelLo 等在線軟件預(yù)測，NtZE1蛋白在細胞外分布的可能性最大。

表2 NtZE1 蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Table 2 Prediction of NtZE1 protein secondary structure

圖3 NtZE1 蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Prediction of NtZE1 protein secondary structure

圖4 NtZE1 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Prediction of NtZE1 protein tertiary structure

圖5 NtZE1 蛋白的信號肽預(yù)測Fig.5 Prediction of NtZE1 protein signal peptide

2.6 NtZE1 基因5’側(cè)翼序列分析及其啟動基因表達的活性檢測

以已知的NtZE1基因EST 序列為基礎(chǔ)，運用Genome walking 技術(shù)對該序列未知的5’側(cè)翼序列進行延長，最終獲得自ATG 起始密碼子前共2578 bp 的5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)。PLACE 和PlantCARE 在線軟件預(yù)測表明，NtZE1基因的表達調(diào)控序列中含有其他大多數(shù)基因表達調(diào)控序列所含有的TATA-box 和CAAT-box 等基本轉(zhuǎn)錄元件。此外，NtZE1基因的5’側(cè)翼序列中可能存在一些與激素、光、脅迫等相關(guān)的順式調(diào)控元件，暗示NtZE1基因可能受多種外界信號調(diào)控。

為驗證所獲得的5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)具有啟動基因表達的能力，對序列進行擴增并通過酶切連接到EGFP 核定位載體中，再借助瞬時表達技術(shù)將載體注入小葉煙草葉表皮細胞。利用熒光顯微鏡觀察經(jīng)注射的葉表皮細胞，發(fā)現(xiàn)在一些細胞的細胞核中有非常清晰的綠色熒光(圖6)。這顯示獲得的NtZE1基因5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)啟動基因表達的活性較強，能被運用于基因功能分析。

圖6 NtZE1 基因5’側(cè)翼序列(啟動子和5’ UTR)啟動基因表達的活性Fig.6 Gene expression activity of NtZE1 5'flanking sequence ( promoter and 5’ UTR)

3 結(jié)論與討論

NtZE1基因在煙草合子中表達，編碼的新型蛋白由105 個氨基酸殘基組成。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中無法查詢到類似的基因序列，因此NtZE1基因的功能暫時未知，其對合子的生長發(fā)育可能有獨特的貢獻。軟件分析預(yù)測在NtZE1蛋白的N 端存在信號肽序列，該蛋白的亞細胞定位可能在細胞外。

目前已經(jīng)將發(fā)現(xiàn)的若干與合子敗育相關(guān)的突變體用于對合子的研究。比如在fac1 突變體中合子的發(fā)育停滯，原因是在合子中表達的FAC1 基因功能缺失，造成其編碼的AMP 脫氨酶(AMPD)無法正常行使功能，因而不能產(chǎn)生更多的能量供給細胞生長所需[4—5]。在gcd1 突變體中合子的發(fā)育也出現(xiàn)停滯，原因是線粒體定位的GCD1 蛋白出現(xiàn)異常，造成卵細胞和中央細胞無法成熟，從而影響后續(xù)的胚胎發(fā)生[6]。同樣定位于線粒體中的MIRO1 蛋白如果發(fā)生突變亦會影響合子發(fā)育，產(chǎn)生合子致死的表型[7]。此外，合子的不等分裂也是植物胚胎發(fā)生中的重要事件，對后續(xù)胚胎發(fā)生過程中的細胞命運決定和胚胎模式建成等具有重要意義。諸如GNOM、RSH、YODA、SSP、GRD、WRKY2、YAO等基因都與合子不等分裂有關(guān)[8—17]。不過上述調(diào)控因子一般都停留在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，而胞外微環(huán)境中的信號分子通過何種途徑影響合子發(fā)育，到目前為止所知甚少。二十多年前，對植物體細胞胚胎發(fā)生的初步研究曾提示，外界的化學(xué)或物理環(huán)境可能影響胚柄的正確形成[18]。近年來對擬南芥Arabidopsis thaliana和玉米Zea mays等的研究也證實，胚胎的正常發(fā)育的確會受到外界環(huán)境的影響[19—21]，但到目前為止，參與調(diào)控植物合子發(fā)育的胞外信號到底有哪些，其具體的分子機理又是什么，所知仍近空白。NtZE1基因的發(fā)現(xiàn)提示一種新型未知功能的胞外蛋白可能在煙草合子的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。本研究以先期獲得的NtZE1基因的EST 序列為基礎(chǔ)，獲得了其5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)。對5’側(cè)翼序列進行克隆后連入EGFP 核定位載體并在小葉煙草葉表皮細胞中瞬時表達，結(jié)果顯示在細胞核中能觀察到明顯的綠色熒光。這說明本研究所獲得的NtZE1基因的5’側(cè)翼序列(啟動子和5’UTR)具有較強的啟動基因表達活性，為以后分析NtZE1基因的表達模式、基因功能等奠定了基礎(chǔ)，有助于豐富對合子發(fā)育調(diào)控機制的認識。