呂 純，高健美，鄧 艷，龔其海

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

神經(jīng)退行性疾病是一類嚴(yán)重影響患者身體健康及生活質(zhì)量，并給其家庭及社會帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)的疾病，其主要病理特征為大腦神經(jīng)元及其髓鞘的退化與缺失[1]。臨床實踐證明，現(xiàn)有的藥物如阿爾茲海默癥治療藥多奈哌齊、美金剛，帕金森病治療藥左旋多巴、司來吉蘭等均只能部分地控制癥狀或延緩病程[2-3]，而且由于其毒性反應(yīng)較大、價格較昂貴等缺點限制了其在臨床的應(yīng)用。有研究報道，神經(jīng)干細胞移植可有效治療神經(jīng)組織損傷[4-5]，但是由于神經(jīng)干細胞獲取的倫理、宗教問題[6]、體內(nèi)致瘤性[7]、長期存活率及表型穩(wěn)定性不理想、純化困難等原因使其在臨床中的應(yīng)用受到限制。因此，探索神經(jīng)退行性疾病的新療法和替代療法有著重要的社會意義及廣闊的臨床應(yīng)用前景。

我國中藥資源豐富，中醫(yī)理法方藥理論齊備，近年多項研究證明中藥復(fù)方、提取物或單體具有良好的保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。多穗石柯[Lithocarpuspolystachys( Wall．) Rehd]又名甜茶或多穗柯，為貴州省民族藥，系殼斗科石柯屬常綠喬木，具有“養(yǎng)陰補腎、護肝解毒、清熱利濕”等功效[8]?，F(xiàn)代研究表明，多穗石柯的主要化學(xué)成分包括黃酮類、三萜類等，同時還包含多酚類、氨基酸、微量元素等[9]，可降血糖降血脂[10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、改善記憶力[13]等。本課題組前期研究表明，多穗石柯葉水提物的主要成分為根皮苷(0.64%)、三葉苷(18.54%)及茶多酚(27.65%)[14]，但是否具有促進神經(jīng)細胞增殖的作用尚未見報道。基于以上背景，本研究旨在探索多穗石柯水提物及其主要成分對PC12細胞的增殖作用，并為探索神經(jīng)退行性疾病的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑及儀器 多穗石柯葉采自貴州省鳳岡縣，由遵義醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室楊建文教授鑒定確屬殼斗科石柯屬植物多穗石柯的干燥葉；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品及三葉苷標(biāo)準(zhǔn)品購自成都普思生物科技股份有限公司；茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。高分化大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自美國ATCC細胞庫；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、青鏈霉素混合液及胰蛋白酶血清購自HyClone公司；澳洲胎牛血清購自Gibco公司；BrdU ELISA 試劑盒購自上海江萊實業(yè)股份有限公司。Midi40二氧化碳培養(yǎng)箱及全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；超凈工作臺(SW-CJ-IFD,泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多穗石柯葉水提物的制備 取30.0 g多穗石柯干燥葉于圓底燒瓶中，按1∶20的料液比加入純凈水，加熱回流30 min后濾過，濾渣重復(fù)提取2次后合并濾液。將提取液減壓濃縮為浸膏，放入真空冷凍干燥機干燥[14]。

1.2.2 PC12細胞的培養(yǎng) 按常規(guī)方法，以含10%胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液的DMEM(高糖)培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃的環(huán)境中培養(yǎng)PC12細胞[15]。待細胞密度達到75%～90%時用磷酸鹽緩沖液洗去培養(yǎng)基后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 PC12細胞增殖能力檢測 當(dāng)PC12細胞進入對數(shù)生長期后，將細胞按1×104、100 μL的濃度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分別加入不同濃度的多穗石柯水提物(0、25、50、75、100、200 μg/L)、根皮苷試劑(0、25、50、75、100、200 μM)、三葉苷試劑(0、25、50、75、100、200 μM)及茶多酚試劑(0、25、50、75、100、200 μM)。各濃度設(shè)6個復(fù)孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h后，按BrdU ELISA試劑盒說明書所述方法操作。

2 結(jié)果

2.1 多穗石柯葉水提物對PC12細胞增殖的作用 實驗結(jié)果表明，25 μg/L和50 μg/L的多穗石柯水提物作用時間為72 h后,PC12細胞的BrdU相對含量(100.43±1.69%，100.66±1.60%)與對照組(100.00±1.79%)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而75 μg/L、100 μg/L和200 μg/L多穗石柯葉水提物較對照組明顯增加PC12細胞BrdU相對含量(120.82±1.19%，162.54±2.51%，168.54±1.33%)[F(5,30)= 199.618，P<0.001](P<0.05)(見圖1)。

**:與對照組比較,P<0.01。 圖1 多穗石柯葉水提物對PC12細胞增殖的作用

2.2 根皮苷對PC12細胞增殖的作用 根皮苷(0、25、50、75、100、200 μM)作用于PC12細胞72 h后，BrdU的相對含量為100.00±1.79%、100.13±1.48%、100.01±1.67%、100.31±1.00%、100.16±1.58%、100.10±1.38%，與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖2)。

**:與對照組比較,P<0.01。 圖2 根皮苷對PC12細胞增殖的作用

2.3 三葉苷對PC12細胞增殖的作用 實驗結(jié)果顯示，25、50 μM三葉苷作用72 h后，PC12細胞的BrdU相對含量(100.25±2.09%，100.11±1.80%)與對照組(100.00±1.79%)相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而75、100、200 μM的三葉苷作用72 h后，BrdU的相對含量分別為112.66±1.75%、143.04±2.45%及149.83±1.72%，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義[F(5,30)= 93.996，P<0.001](P<0.05，見圖3)。

**:與對照組比較,P<0.01。圖3 三葉苷對PC12細胞增殖的作用

2.4 茶多酚對PC12細胞增殖的作用 不同濃度的茶多酚(25、50、75、100、200 μM)作用72 h后，PC12細胞BrdU的相對含量(100.34±1.71%、99.99±1.50%、100.07±1.73%、100.77±1.79%、100.35±1.78%)與對照組(100.00±1.79%)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

圖4 茶多酚對PC12細胞增殖的作用

3 討論

隨著我國人口老齡化日益嚴(yán)重，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尋找有益于神經(jīng)系統(tǒng)功能維持的化合物意義重大。多穗石柯葉是一種我國使用悠久、藥食同源的植物，常以“甜茶”、“甘茶”等形式出現(xiàn)在老百姓的生活中，因此本實驗采用多穗石柯葉水提物為研究對象。高分化大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞，來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)腫瘤克隆細胞系，因其具有交感神經(jīng)元特性，現(xiàn)已廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)的體外研究[10-11,15-19]。BrdU是一種人工合成的胸腺嘧啶類似物，可在合成期滲入DNA分子中，在細胞培養(yǎng)時加入BrdU,再與BrdU單克隆抗體相結(jié)合，可反映細胞的增殖情況。因此，本研究采用BrdU ELISA法觀察多穗石柯葉水提物及其主要成分 對PC12細胞增殖的影響。本研究結(jié)果表明，多穗石柯葉水提物可以明顯促進PC12細胞的增殖，其主要成分三葉苷同樣有顯著的促PC12細胞增殖作用，而根皮苷和茶多酚對PC12細胞增殖作用無影響。提示多穗石柯水提物中的三葉苷可能是其促增殖作用的主要成分，這與本課題組的前期研究結(jié)論一致[18]。值得注意的是，三葉苷作用的PC12細胞的BrdU相對含量低于多穗石柯水提物作用的PC12細胞的BrdU相對含量，表明三葉苷的促增殖作用低于多穗石柯葉水提物。推測其原因可能于多穗石柯中含有多種化學(xué)成分，還有其他成分發(fā)揮促增殖的作用，或者由于各成分間的相互作用使其促增殖作用明顯增加有關(guān)，但是具體原因及其可能的作用機制尚需進一步研究探索。

綜上所述，在本實驗條件下，多穗石柯葉水提物的促增殖作用可能與其主要成分三葉苷有關(guān)。但本研究初步探索了多穗石柯水提物、根皮苷、三葉苷和茶多酚對PC12細胞增殖的影響，并未對其作用機制進行分析。因此，在未來的研究中將進一步采用多種實驗法，例如EDU熒光染色、流式細胞術(shù)、Western blot法等進一步驗證多穗石柯水提物及其主要活性成分對PC12細胞的影響及其作用機制。本研究可為多穗石柯防治神經(jīng)退行性疾病以及腦損傷的研究提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。