馬思雨，王 鵬，楊玉志，孫劍飛，顧 寧

(1.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210096)(2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)工程處，江蘇 南京 210008)(3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與成人重建外科，江蘇 南京 210008)(4.蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123)

1 前 言

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力并能夠進(jìn)行分化的多功能細(xì)胞，將干細(xì)胞移植到體內(nèi)后可以實(shí)現(xiàn)組織或器官的再生[1]。干細(xì)胞主要通過分化成為目標(biāo)組織、用于基因治療、通過旁分泌改善微環(huán)境等幾種方式進(jìn)行組織修復(fù)或器官再生[1]。干細(xì)胞治療是目前組織修復(fù)領(lǐng)域最有前景的治療方法之一，但是對(duì)干細(xì)胞移植后分布、活性、分化方向、作用機(jī)制等認(rèn)知的缺乏，成為制約干細(xì)胞治療進(jìn)一步研究的主要瓶頸。目前運(yùn)用一些方法可以對(duì)移植到體內(nèi)的干細(xì)胞的分布、活性等情況進(jìn)行檢測(cè)，例如用磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞后，利用磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance imaging,MRI)有望實(shí)現(xiàn)體外無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、安全、有效的長(zhǎng)期示蹤觀察和檢測(cè)。磁性納米顆粒具有生物可降解、溫和無毒的性質(zhì)，并且可以通過調(diào)節(jié)粒徑調(diào)控磁性[2]，磁性納米顆粒在干細(xì)胞研究中主要作為磁共振比對(duì)劑，應(yīng)用于干細(xì)胞示蹤，且磁性納米顆粒的MRI成像技術(shù)具有靈敏度高、副作用較少、可降解、體內(nèi)留存時(shí)間長(zhǎng)、毒性低等優(yōu)點(diǎn)[3]。但目前標(biāo)記的干細(xì)胞在體內(nèi)死亡、裂解后釋放的氧化鐵納米顆粒能否造成非特異成像目前尚未定論；且由于氧化鐵納米顆粒不能隨細(xì)胞的分裂而進(jìn)行自體復(fù)制，所以在監(jiān)測(cè)移植后干細(xì)胞的增殖和分化方面存在一定不足[4]。常見的納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的方式有兩種，一種是將納米顆粒依附于細(xì)胞表面，另一種是細(xì)胞將納米顆粒內(nèi)在化，主要包括直接胞吞作用、受體介導(dǎo)的胞吞作用及轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)的胞吞作用[5,6]。此外，還可以通過外加電磁場(chǎng)、在磁性納米顆粒表面修飾能與靶細(xì)胞膜上受體結(jié)合的配體等方法調(diào)控磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞。本文對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的組織修復(fù)原理、磁性納米顆粒參與協(xié)助間充質(zhì)干細(xì)胞的組織修復(fù)以及現(xiàn)有的磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞用于組織修復(fù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)的一種多能干細(xì)胞，隨后在骨骼、肌肉、脂肪、肝、肺、臍帶血、羊水中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[1]。MSCs不僅具有干細(xì)胞獨(dú)特的自我更新的能力，還可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為不同的組織，如肌肉組織、骨組織、軟骨組織、神經(jīng)組織、脂肪組織、內(nèi)皮組織、上皮組織等[7]。而且，移植到體內(nèi)后可以遷移到受損組織部位，抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放，從而提高受損細(xì)胞的存活率[1]。一般MSCs的分離方法相對(duì)其他細(xì)胞而言較為簡(jiǎn)單，并且分離后能夠在體外迅速擴(kuò)增，這使得其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛[8]。MSCs主要通過分化成目標(biāo)組織、用于基因治療、通過旁分泌改善微環(huán)境等幾種方式進(jìn)行組織修復(fù)。

(1)MSCs分化為目標(biāo)組織治療疾病

通過系統(tǒng)性移植MSCs可以治療一些全身性疾病或局部組織、器官的病變，如血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤以及糖尿病胰島功能缺陷等[1,9]。體外培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs并誘導(dǎo)其分化，發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs分化的細(xì)胞呈典型的胰島樣細(xì)胞增殖。已經(jīng)分化的細(xì)胞內(nèi)胰島素mRNA蛋白呈陽性表達(dá)，而且分泌到細(xì)胞外的胰島素水平明顯高于分化前的細(xì)胞。將其注入糖尿病大鼠體內(nèi)可以顯著調(diào)節(jié)血糖水平，這對(duì)利用干細(xì)胞治療糖尿病提供了新的思路[9-11]。

MSCs在進(jìn)行系統(tǒng)移植時(shí)，還可以通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)和局部環(huán)境定位到特定的組織和器官。在多項(xiàng)臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，MSCs通過誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，重建心血管及肌肉功能，參與恢復(fù)心肌梗死后充血性心力衰竭。此外，將MSCs經(jīng)靜脈注射或直接注射到梗死區(qū)域后，MSCs均可以定位聚集于損傷區(qū)，定向分化為心肌細(xì)胞，從而改善心功能[12-14]。

(2)MSCs用于基因治療

MSCs在基因治療中是一種極為理想的靶細(xì)胞，在移植前可以將多種外源性目的基因整合至MSCs基因組DNA，移植后能夠長(zhǎng)期表達(dá)。MSCs不僅能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染外源性的基因，而且表達(dá)的外源基因具有生物活性。研究表明，構(gòu)建B區(qū)缺失的VIII因子cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以人的MSCs為靶細(xì)胞，在優(yōu)化的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件下可以使MSCs表達(dá)VIII因子[15,16]。

(3)MSCs通過自身旁分泌改善微環(huán)境

除了利用干細(xì)胞移植治療疾病外，一些疾病還能夠利用MSCs分泌的某些細(xì)胞活性因子進(jìn)行治療。例如成體大腦損傷后很難治愈，原因在于成體大腦很少會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)和軸突的再生，受到損傷后中樞神經(jīng)自發(fā)修復(fù)很有限，因此可以嘗試用干細(xì)胞分泌的細(xì)胞活性因子治療中樞神經(jīng)損傷。Wimpenny等[17]發(fā)現(xiàn)移植的MSCs可以釋放活性軟骨形成蛋白BMP-4，該蛋白能夠促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞和干細(xì)胞內(nèi)的星型膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

骨髓MSCs是目前常用于細(xì)胞移植治療的組織工程種子細(xì)胞，很多研究都致力于利用骨髓MSCs修復(fù)各種缺血梗死的機(jī)體組織[18-21]。骨髓MSCs可以通過旁分泌生成血管生成因子及分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞等途徑來促進(jìn)血管再生，從而改善組織供血情況。Schumann等[22]將乳酸乙醇酸支架結(jié)合成骨樣細(xì)胞的生成血管能力與骨髓MSCs的進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)成骨樣細(xì)胞與骨髓MSCs分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相當(dāng)，血管密度基本一致。近年來有學(xué)者提出，骨髓MSCs的旁分泌機(jī)制是促進(jìn)血管再生的主要機(jī)制，骨髓中的MSCs主要功能是支持造血、改善造血環(huán)境；造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與MSCs、細(xì)胞外基質(zhì)以及血管組成的微環(huán)境的接觸可以促進(jìn)骨髓中的紅細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等細(xì)胞的分化和成熟[23]。造血祖細(xì)胞與MSCs的直接接觸是通過表面黏附的相關(guān)分子實(shí)現(xiàn)的，這種接觸能夠定位造血祖細(xì)胞。血管的形成過程需要許多生長(zhǎng)因子的參與，通過MSCs分泌的多種細(xì)胞因子，如促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和促動(dòng)脈生成長(zhǎng)因子等，可以以旁分泌的方式調(diào)控造血細(xì)胞的分化與成熟，進(jìn)而促進(jìn)新血管的形成，圖1為新血管形成機(jī)制示意圖[24]。

圖1 新生血管形成機(jī)制示意圖[24]Fig.1 Schematic diagram of angiogenesis mechanism[24]

爆發(fā)性肝衰竭是一種死亡率極高的疾病，Shi等[25]利用骨髓MSCs的肝內(nèi)移植成功治療了患有爆發(fā)性肝衰竭的大動(dòng)物(豬)。利用多組學(xué)功能關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)移植的干細(xì)胞主要是通過抑制炎癥介質(zhì)分泌、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等旁分泌作用，來改變宿主對(duì)爆發(fā)性肝衰竭損傷的響應(yīng)，最終促進(jìn)宿主自身肝臟再生修復(fù)。

3 磁性納米顆粒在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

納米尺度的磁性材料(即磁性納米材料)，因其具有良好的尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)和獨(dú)特的磁性效應(yīng)，引起了研究人員的極大興趣[26]。尤其是磁性氧化鐵納米顆粒，如Fe3O4納米材料(磁鐵礦)和γ-Fe2O3納米材料(磁赤鐵礦)，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[27,28]。磁性納米材料并不只有人工合成的，很早之前人們就在大自然和一些生命體中發(fā)現(xiàn)了磁性納米材料，尤其是氧化鐵納米顆粒，人們?cè)谮叴偶?xì)菌[29]、魚類[30]、昆蟲[31]和鳥類[32]體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了氧化鐵納米顆粒的存在。生命體可以利用自身的氧化鐵納米顆粒感知地球磁場(chǎng)，從而進(jìn)行導(dǎo)航。氧化鐵納米顆粒具有生物可降解、溫和無毒的性質(zhì)，并且可以通過調(diào)節(jié)粒徑調(diào)控磁性[2]，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。氧化鐵磁性納米顆粒由氧化鐵顆粒、生物相容性外衣、間隔臂及活性分子構(gòu)成，其核心顆粒大小及表面修飾均會(huì)影響磁性氧化鐵納米顆粒的磁性及其他性能[33]。最初用于MRI和貧血治療的氧化鐵納米顆粒Ferumoxytol，是目前美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的唯一可用于臨床的無機(jī)納米材料，因其具有良好的安全性，已被作為藥物廣泛用于炎癥和腫瘤成像的臨床實(shí)驗(yàn)[34]。目前，藥用氧化鐵納米材料主要應(yīng)用于核磁共振造影、體外生物分離、腫瘤磁流體熱療3大領(lǐng)域。氧化鐵磁性納米顆粒在干細(xì)胞研究中主要作為磁共振比對(duì)劑，應(yīng)用于干細(xì)胞示蹤。

3.1 磁共振對(duì)比劑

水占了人體質(zhì)量的2/3左右，人體中各個(gè)器官和組織中水含量不同，當(dāng)器官或組織發(fā)生病變時(shí)，其水含量也會(huì)發(fā)生改變。MRI的原理就是利用生物體內(nèi)水分子質(zhì)子在外加磁場(chǎng)作用下產(chǎn)生不同的射頻信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后轉(zhuǎn)化成圖像信息，其信號(hào)的強(qiáng)弱取決于生物體組織內(nèi)含水量的多少。與計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)等成像技術(shù)相比，MRI無放射性，不會(huì)對(duì)人體組織細(xì)胞產(chǎn)生電離輻射，同時(shí)還可以通過不同的掃描序列和參數(shù)獲得大量反映體內(nèi)正常組織和各種病變的信息，從而能夠準(zhǔn)確地定位病變部位，判斷病變性質(zhì)[35]。

對(duì)于病變的組織或器官，其含水量雖然與正常組織不同，但有時(shí)利用這種固有的組織特性產(chǎn)生的對(duì)比度不能精準(zhǔn)地確定某些病變的性質(zhì)，這就需要特殊制備的藥物，經(jīng)腸胃給藥或靜脈注射的方式分布到生物體的病變組織，引起病變組織和正常組織的明顯不同，從而快速準(zhǔn)確地診斷出病變部位。這種特殊制備的藥物就是MRI對(duì)比度增強(qiáng)劑，簡(jiǎn)稱對(duì)比劑。對(duì)比劑本身并不產(chǎn)生信號(hào)，它是通過改變組織內(nèi)的水含量，也就是氫核系統(tǒng)的弛豫時(shí)間，使病變組織與周圍組織形成明顯對(duì)比[36]。

目前臨床中廣泛使用的是順磁性金屬釓離子(Gd3+)的各種配合物和超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)作為MRI對(duì)比劑[37]。Gd3+對(duì)人體的毒性很高，在體內(nèi)沉積后，影響Ca2+、Zn2+等離子的代謝，并對(duì)心臟和神經(jīng)有很大的毒性[38]。雖然Gd3+可以與螯合分子形成穩(wěn)定的配合物降低其毒性，但是臨床許可的安全用量仍然很低。最近一些研究表明，Gd3+對(duì)比劑的使用會(huì)造成肝腎功能不全的患者形成腎源性系統(tǒng)性纖維化，從而使得該類對(duì)比劑的安全性遭到質(zhì)疑[39,40]。然而，相較于Gd3+，SPIONs的MRI成像靈敏度高、副作用較少、可降解、體內(nèi)留存時(shí)間長(zhǎng)且毒性低[3]。此外，鐵是人體所需的必須微量元素之一，成年人體內(nèi)鐵含量高達(dá)3～4 g，氧化鐵納米顆粒進(jìn)入人體后半個(gè)月之內(nèi)可以被人體降解吸收，安全性遠(yuǎn)高于釓配合物[41]。圖2為Gd3+對(duì)比劑與氧化鐵納米顆粒對(duì)比劑在神經(jīng)膠質(zhì)瘤假性進(jìn)展方面的成像效果對(duì)比圖。圖2顯示氧化鐵納米顆粒對(duì)比劑沒有外泄，但Gd3+對(duì)比劑有明顯的泄露情況，如圖2中箭頭所示[42]。與Gd3+對(duì)比劑不同，對(duì)氧化鐵納米顆粒不需要進(jìn)行泄露校正[40]。而且，氧化鐵納米顆粒作為對(duì)比劑時(shí)能夠區(qū)分腫瘤進(jìn)展和假性進(jìn)展，是良好的預(yù)后生物標(biāo)志物。當(dāng)有SPIONs存在時(shí)，會(huì)干擾固有磁場(chǎng)的均勻性，使其所在部位與周圍組織產(chǎn)生不同的磁場(chǎng)敏感性，造成周圍質(zhì)子的快速移相，導(dǎo)致在T2和T1成像的弛豫時(shí)間減少[38]。SPIONs作為T2磁共振對(duì)比劑的主要作用是改變MRI的R2弛豫，縮短T2時(shí)間，減弱T2加權(quán)信號(hào)。其在納米范圍內(nèi)穿透能力強(qiáng)，弛豫率為等濃度Gd3+的7～10倍，能在很低濃度下引起MRI成像，表現(xiàn)為信號(hào)減低區(qū)域，能與周圍組織形成對(duì)比。

但是，利用磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行MRI示蹤也存在一些問題，例如靈敏度相對(duì)不足，且標(biāo)記的干細(xì)胞在體內(nèi)死亡、裂解后釋放的氧化鐵納米顆粒能否造成非特異成像目前尚未定論；由于氧化鐵納米顆粒不能隨細(xì)胞的分裂而進(jìn)行自體復(fù)制，所以在監(jiān)測(cè)移植后干細(xì)胞的增殖和分化方面存在一定不足[4]。

圖2 Gd3+對(duì)比劑與氧化鐵納米顆粒對(duì)比劑成像效果對(duì)比圖[42]Fig.2 Comparison of imaging effects between Gd3+ contrast agent and iron oxide nanoparticle contrast agent[42]

3.2 體內(nèi)細(xì)胞示蹤

細(xì)胞治療中的一個(gè)重要問題是細(xì)胞移植進(jìn)入體內(nèi)后如何對(duì)其進(jìn)行區(qū)分和示蹤，以監(jiān)視它們的遷移、增殖、活性、凋亡等情況。目前，在臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)室中多采用組織分析或病理活檢等有創(chuàng)檢查方法來評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移、分化、增殖以及存活數(shù)量等具體情況。這兩種方法都只能對(duì)所取出的部分進(jìn)行檢查，并不能完全反映移植細(xì)胞的動(dòng)態(tài)遷移及在體內(nèi)的生存情況。要闡明治療效果的潛在機(jī)制，就必須全面評(píng)價(jià)移植到體內(nèi)的MSCs的生存狀態(tài)及遷移情況。因此，細(xì)胞水平的MRI無疑為無創(chuàng)觀察體內(nèi)細(xì)胞遷移和實(shí)施細(xì)胞追蹤提供了一種新的思路[43]。

MRI一般需要將移植細(xì)胞標(biāo)記對(duì)比劑，以加強(qiáng)正常組織與移植細(xì)胞之間的明暗對(duì)比，但目前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行納米材料的標(biāo)記尚無一套標(biāo)準(zhǔn)化流程。一般將待標(biāo)記細(xì)胞與納米材料在體外進(jìn)行共孵育，待納米材料進(jìn)入細(xì)胞后，收集、清洗已標(biāo)記的細(xì)胞，然后將標(biāo)記細(xì)胞移植入動(dòng)物或人體內(nèi)，借助MRI技術(shù)觀察細(xì)胞的遷移和分布。細(xì)胞示蹤常用于免疫細(xì)胞示蹤和干細(xì)胞示蹤。由于順磁性金屬離子，如Gd3+、Mn2+標(biāo)記細(xì)胞的靈敏度較低，需要大量的標(biāo)記細(xì)胞，而納米顆?；慕饘匐x子如SPIONs在磁共振掃描儀中可以產(chǎn)生很強(qiáng)的局部磁場(chǎng)，加速周圍水質(zhì)子的弛豫速率從而產(chǎn)生很強(qiáng)的陰影對(duì)比效果，在超順磁性納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞存在的區(qū)域明顯變暗，因此常用磁性納米顆粒標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞示蹤[44]。

超順磁性納米顆粒標(biāo)記的細(xì)胞用于MRI示蹤已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種類型的臨床前研究，例如自身免疫T細(xì)胞的器官特異性歸巢、毒性T細(xì)胞[45]和自然殺傷細(xì)胞[46]的腫瘤歸巢以及癌癥疫苗中DC細(xì)胞的遷移模式等研究[47]。當(dāng)平均每個(gè)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)細(xì)胞內(nèi)的鐵含量為25 pg時(shí)，在磁場(chǎng)強(qiáng)度3 T下可檢測(cè)到100 cells/mm2[48]。例如，2009年的一項(xiàng)研究顯示，將標(biāo)記了超順磁性納米顆粒的DC注射到骨髓移植的小鼠右后腿8 d后，利用MRI觀察到在小鼠頸部的淋巴結(jié)有明顯的信號(hào)減弱，顯示出DC發(fā)生了定向的遷移[49]。

細(xì)胞標(biāo)記中很重要的一點(diǎn)是任何標(biāo)記都不能在本質(zhì)上改變細(xì)胞的性質(zhì)，如干細(xì)胞不能改變其分化功能，免疫細(xì)胞不能改變其免疫學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞功能一旦發(fā)生改變，會(huì)引起治療效率的減弱甚至消失。而且，標(biāo)記細(xì)胞的磁性納米顆粒不能對(duì)細(xì)胞活力、數(shù)量有明顯影響，不能引起明顯的細(xì)胞毒性。雖然磁性納米顆粒標(biāo)記的干細(xì)胞能夠達(dá)到這些細(xì)胞安全性的要求[50]，然而也存在一些局限性，例如干細(xì)胞的分裂會(huì)稀釋細(xì)胞內(nèi)磁性納米顆粒的濃度，從而影響長(zhǎng)時(shí)間的觀察效果；細(xì)胞的死亡會(huì)導(dǎo)致磁性納米顆粒的分散等。因此如何在保證干細(xì)胞的細(xì)胞活性、增殖能力的前提下，提高磁性納米顆粒的標(biāo)記效率是干細(xì)胞示蹤的首要問題[51]。

3.3 磁性納米顆粒對(duì)干細(xì)胞生命活動(dòng)的影響

目前，磁性納米顆粒調(diào)節(jié)干細(xì)胞生命活動(dòng)的研究還比較少，研究表明一些磁性納米顆粒在某些特定條件下可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化，但其作用的效果及具體原因有待進(jìn)一步研究，臨床應(yīng)用也有待進(jìn)一步開發(fā)[52]。

一些磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞后，可以通過促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)而增強(qiáng)其組織修復(fù)的功效，如促進(jìn)骨髓MSCs的成骨分化和體內(nèi)骨再生[53]。Huang等[54]報(bào)道了一種對(duì)人骨髓MSCs無毒性的磁性氧化鐵納米顆粒，能夠促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種磁性納米顆?？梢酝ㄟ^提高細(xì)胞內(nèi)過氧化物的活性從而減小細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫；此外，還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，加速細(xì)胞周期，從而增強(qiáng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)[55]。

Wang等[55,56]利用基因芯片和生物信息學(xué)分析，更好地解釋了磁性納米顆粒促進(jìn)骨髓MSCs成骨分化的分子機(jī)制。其結(jié)果表明，干細(xì)胞的基因表達(dá)受到磁性納米顆粒的調(diào)控，經(jīng)典的MAPK信號(hào)通路被激活。因此，該通路下游的基因被調(diào)控，從而增強(qiáng)了成骨分化。在分子水平上，磁性納米顆粒上調(diào)了對(duì)于成骨分化至關(guān)重要的RNA INZEB2的表達(dá)，INZEB2的過表達(dá)抑制了ZEB2的表達(dá)，而ZEB2是抑制成骨轉(zhuǎn)錄的必需因子。圖3為磁性納米顆粒促進(jìn)成骨分化示意圖。這些結(jié)果讓我們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)磁性納米顆粒促進(jìn)成骨分化的機(jī)制有了更加深入的理解，為促進(jìn)磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[53-56]。

此外，將含有超順磁性納米顆粒的明膠海綿植入SD大鼠的門牙窩中，與對(duì)照組相比，骨再生明顯增強(qiáng)，成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更好的成骨和血管生成性能[53,57]。

4 磁性納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的方式

納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的方式主要有兩種，一種是將納米顆粒依附于細(xì)胞表面，另一種是細(xì)胞將納米顆粒內(nèi)在化，主要包括直接胞吞作用、受體介導(dǎo)的胞吞作用及轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)的胞吞作用[5,6]，圖4為納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的不同途徑。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，第一種方式有明顯的局限性，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會(huì)識(shí)別并清除這些SPIONs標(biāo)記的細(xì)胞。而通過內(nèi)在化途徑，納米顆粒會(huì)留存在干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并具有良好的生物相容性[58]。而對(duì)于某些非吞噬性細(xì)胞，內(nèi)化納米顆粒的效率很低，可以通過在納米顆粒表面包裹病毒包膜或帶正電的高分子聚合物提高轉(zhuǎn)染效率?，F(xiàn)階段可用于納米顆粒內(nèi)化的轉(zhuǎn)染劑有多聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺等[59-61]。

圖3 磁性納米顆粒促進(jìn)成骨分化示意圖[55]Fig.3 Schematic illustration of iron oxide nanoparticles promoting osteogenic differentiation[55]

圖4 納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的不同途徑[6]Fig.4 Different internalization pathways of nanoparticles[6]

目前，增強(qiáng)SPIONs跨膜的方法有：外加電磁場(chǎng)使磁性納米顆粒向照射部位靶向聚集[62,63]；在超順磁性納米顆粒表面修飾能與靶細(xì)胞膜上受體結(jié)合的配體，使得SPIONs與靶細(xì)胞特異性結(jié)合[64]；促進(jìn)單核-吞噬細(xì)胞吞噬SPIONs，促進(jìn)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；將納米顆粒與微氣泡共混合或?qū)⒓{米顆?；瘜W(xué)偶聯(lián)到微氣泡膜殼表面后超聲輻照，可以提高納米顆粒的標(biāo)記效率。

Yang等[48]將細(xì)胞培養(yǎng)于磁控組裝基底上時(shí)，會(huì)減少磁性納米顆粒對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記。其原因在于組裝體可以促進(jìn)前纖維蛋白基因過表達(dá)，而過表達(dá)的前纖維蛋白會(huì)抑制內(nèi)吞及膜循環(huán)，造成細(xì)胞對(duì)磁性納米顆粒攝取減少。

細(xì)胞標(biāo)記率與SPIONs濃度呈正相關(guān)，SPIONs濃度越高，細(xì)胞標(biāo)記效率越高，但過高的濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵含量過多，影響細(xì)胞生物學(xué)活性及增殖能力。SPIONs標(biāo)記細(xì)胞的有效安全濃度為20～50 mg/L，以適量濃度標(biāo)記干細(xì)胞，不會(huì)對(duì)其生物學(xué)活性、增殖能力及多向分化能力產(chǎn)生明顯影響[57]。但無論用哪種方法進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)記，標(biāo)記效率與細(xì)胞種類都有著密不可分的關(guān)系，在移植前需要對(duì)每種類型的細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。其次，在移植前必須對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行徹底的清洗以便去除過量的納米顆粒，避免殘留在細(xì)胞外的納米顆粒導(dǎo)致假陽性信號(hào)[58]。

5 結(jié) 語

干細(xì)胞治療是目前組織修復(fù)領(lǐng)域中最有潛力的治療方法，但由于缺乏有效的干細(xì)胞示蹤技術(shù)等原因，對(duì)干細(xì)胞移植后的分布、活性、分化方向、作用機(jī)制等認(rèn)知較為缺乏，目前的多數(shù)研究都還停留在實(shí)驗(yàn)階段。需要利用干細(xì)胞體內(nèi)示蹤技術(shù)對(duì)移植到體內(nèi)后干細(xì)胞的分布、活性、分化、凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。MRI成像由于其無輻射、信號(hào)穿透衰減少、空間分辨率高、與組織對(duì)比度大等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)階段比較合適的一種干細(xì)胞示蹤方式，且磁性納米顆粒作為MRI的對(duì)比劑，有著毒性小、生物相容性好、在體內(nèi)維持循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、成像質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。磁性納米顆粒除了作為對(duì)比劑外，還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細(xì)胞、促進(jìn)干細(xì)胞的分化。但磁性納米顆粒依然存在其應(yīng)用的一些局限性，例如干細(xì)胞移植體內(nèi)后，其活性、分化、遷移等性質(zhì)的改變可能會(huì)影響干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的治療、安全性等問題，因此目前多數(shù)研究?jī)H處在體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物研究階段。目前促進(jìn)納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的方法中，將磁性納米顆粒進(jìn)行表面修飾可以提高標(biāo)記量，物理場(chǎng)的作用特點(diǎn)在于可以實(shí)現(xiàn)快速標(biāo)記，結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì)將是未來標(biāo)記方式的發(fā)展趨勢(shì)。磁性納米材料作為一種新的細(xì)胞標(biāo)記途徑具有廣闊的前景，相信隨著干細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)和分子影像技術(shù)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞移植體內(nèi)后的治療、安全性問題得到解決，磁性納米材料將在干細(xì)胞治療這一重要領(lǐng)域大展身手。