陳笑釵，李婷，黃炳文，蔣予箭*

(1.浙江五味和食品有限公司，浙江 湖州 313213；2.浙江工商大學 食品與生物工程學院，杭州 310018)

不同的發(fā)酵工藝使食醋香氣成分在量上有很大差異[1]。形成食醋香氣的成分主要包括酸類、酯類、醇類等揮發(fā)性成分。固相微萃取(SPME)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種樣品前處理技術(shù)，常與GC-MS聯(lián)用來分析和鑒定風味物質(zhì)[2,3]，它集萃取、濃縮、進樣為一體，選擇性和重現(xiàn)性好，靈敏度高，提高了分析檢測的效率和準確性。近年來多研究食醋香氣物質(zhì)的定性分析，但關(guān)于浙江玫瑰醋所得成品的香氣主要組成成分及定量分析的方法研究少有報道。

已經(jīng)研究了補料發(fā)酵技術(shù)對玫瑰醋生產(chǎn)工藝改良的可行性，在控溫(31±1) ℃發(fā)酵條件下，初始酸度2.5 g/dL時補加1/2體積的稀釋至酒精度6%酒液，醋酸發(fā)酵結(jié)束時，酸度最高上升到(5.48±0.27) g/dL，與傳統(tǒng)工藝最高酸度達(4.81±0.15 ) g/dL對比，酒精轉(zhuǎn)化醋酸的效率得到提高，醋酸生成量增加。并且補料工藝對玫瑰醋色澤形成無顯著影響。補料工藝玫瑰醋符合產(chǎn)品標準，且酸度比傳統(tǒng)發(fā)酵高，提高了產(chǎn)品得率，經(jīng)過感官品評分析，補料產(chǎn)品保留了傳統(tǒng)工藝玫瑰醋的主要風味特性[4,5]。玫瑰醋補料發(fā)酵技術(shù)路線見圖1。

圖1 工藝流程Fig.1 Technological process

本文對固相微萃取條件進行了優(yōu)化，考察萃取頭、萃取時間、萃取溫度對玫瑰醋樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)萃取的影響[6]，采用內(nèi)標法對香氣成分定量，測定其有效性及回收率，建立玫瑰醋揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定方法，對傳統(tǒng)及補料發(fā)酵生產(chǎn)的浙江玫瑰醋香氣成分組成進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸：均為色譜純；氯化鈉、無水乙醇：均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AR2140型電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；固相萃取纖維頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA) 美國Supelco公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；AL204型電子分析天平 深圳市科衡儀器電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香氣物質(zhì)測定方法的建立

1.3.1.1 萃取頭的老化

在使用固相萃取纖維頭之前，必須進行老化，老化至無雜質(zhì)的干擾峰出現(xiàn)。在氣相色譜的進樣口處，將萃取頭于240 ℃老化30 min。

1.3.1.2 SPME樣品前處理

取樣品10 mL置于20 mL頂空瓶中，用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。先將頂空瓶放入恒溫水浴鍋平衡30 min，然后將萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，在一定溫度下吸附一定時間。之后抽回纖維頭，從頂空瓶中拔出萃取頭，取出后將萃取頭量程調(diào)為4 cm，插入GC-MS儀的氣相色譜進樣口，推出纖維頭，于240 ℃下解吸2 min，進行GC-MS分析。

1.3.1.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱：DB-WAX，60 m×0.25 mm×0.5 μm(柱長×內(nèi)徑×膜厚)；進樣口溫度：240 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，恒流模式，柱流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍33～500 amu。

1.3.1.4 SPME萃取參數(shù)條件優(yōu)化

a.萃取頭的選擇

實驗選擇食品香氣分析中2種常用的纖維萃取頭，非極性復合涂層50/30 μm DVB/CAR/PDMS和強極性85 μm PA萃取頭，以固相微萃取后進樣測定的化合物總色譜峰面積和色譜峰數(shù)為指標，比較以上2種萃取頭對浙江玫瑰醋樣品的萃取效果。

b.SPME的萃取條件優(yōu)化

結(jié)合文獻可知，固相微萃取的萃取時間及溫度的選擇對萃取效果有很大的影響，在萃取揮發(fā)性風味物質(zhì)時，加入適當濃度鹽類可有效提高揮發(fā)性成分在頂空的濃度[7]。在萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，樣品中添加150 g/L濃度NaCl的基礎(chǔ)上，比較不同萃取溫度(30，40，50，60，70 ℃)，不同萃取時間(20，30，40，50，60 min)，不同NaCl質(zhì)量濃度(150，200，250，300，350 g/L)對玫瑰醋香氣物質(zhì)萃取效果的影響。

1.3.2 玫瑰醋中香氣成分的定性分析

采用計算機檢索譜庫，由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物通過計算機檢索與NIST DEMO 2.0譜庫相匹配，對正反匹配度都大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果給予定性，結(jié)合化學成分的保留時間、質(zhì)譜圖譜、實際成分和保留指數(shù)等鑒定化合物結(jié)構(gòu)，從而確定浙江玫瑰醋的香氣組成成分。

1.3.3 玫瑰醋中香氣成分的定量分析

1.3.3.1 內(nèi)標物的配制

內(nèi)標物的選擇原則有：(1)與被分析物質(zhì)的物理化學性質(zhì)要相似(如：沸點、極性、化學結(jié)構(gòu)等)；(2)被分析試樣中不存在的純物質(zhì)；(3)能完全溶于被測物品(或溶劑)中，且不與被測樣品起化學反應，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離[8]。本實驗選擇2-乙基丁酸作為內(nèi)標物。準確吸取2 mL的2-乙基丁酸于100 mL容量瓶中，用20%乙醇定容，配制的內(nèi)標物濃度為159.18 mg/L。

1.3.3.2 混合標準溶液的配制與相對響應因子的測定

選擇食醋中常見的幾種代表性酸類、酯類、醇類和醛類物質(zhì)，測定它們對內(nèi)標物2-乙基丁酸的相對響應因子。除醛類外，其他的羰基化合物和雜環(huán)化合物以與醛類物質(zhì)的相對響應因子計算[9]。

選擇β-苯乙醇、乙酸、乙酸乙酯、苯甲醛組分，配制體積百分比1.0 mL/L的標準儲備液。測定相對響應因子時將標樣稀釋10倍，則標準液中各組分濃度為0.1 mL/L。

采用加標法測定各組分的相對校正因子，取一定量的混合標液加入到玫瑰醋樣品中，通過峰面積的增大量來計算該組分的校正因子。以2-乙基丁酸為內(nèi)標物，將內(nèi)標物和標樣等體積混合后，吸取100 μL加入到10 mL醋樣中，在1.3.1.3的GC-MS分析條件下進樣，計算各香氣組分的相對校正因子，得出各組分的保留時間和峰面積。相對校正因子(fi)的計算公式：

(1)

式中：ΔAi和ΔWi分別表示組分標品i的增加含量和對應增加的峰面積；As和Ws表示內(nèi)標物s的含量與峰面積。

待測風味物質(zhì)的含量計算公式：

(2)

式中：Wi和Ai分別是被測組分的含量與峰面積；Ws和As分別為內(nèi)標物的含量與峰面積。

1.3.4 香氣測定方法有效性評價

取同一玫瑰醋樣品，分別萃取5次后進樣，選取相對含量較大，出峰時間間隔較大的多種香氣組分，對其保留時間和相對含量進行再現(xiàn)性和回收率測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣成分測定萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取纖維頭的選擇

萃取頭是SPME裝置的核心組成部位，不同固定相構(gòu)成的萃取頭型號會影響對物質(zhì)的萃取吸附能力。本實驗比較了50/30 μm DVB/CAR/PDMS和85 μm PA 2種纖維頭在相同的吸附條件(40 ℃吸附30 min)和解吸附條件(240 ℃解吸2 min)下，對浙江玫瑰醋揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取效果，結(jié)果見圖2。

圖2 不同萃取纖維頭對萃取效果的影響Fig.2 The extraction effect of different extraction fiber heads

由圖2可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭的萃取效果明顯較好，總峰面積為1.54×109，幾乎是85 μm PA總峰面積的1.48倍。從檢出的有效化合物個數(shù)來看，50/30 μm DVB/CAR/PDMS檢出了56種化合物，而85 μm PA檢出了43種化合物。型號為50/30 μm DVB/CAR/PDMS復合涂層的萃取頭對玫瑰醋樣品來說，進行風味萃取更為合適，分離出的化合物較全面，色譜分析響應值較高，且風味強度較大，故選擇此型號作為萃取玫瑰醋風味物質(zhì)的萃取頭。

2.1.2 萃取時間的選擇

選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取溫度為40 ℃的條件下，以可檢出的總峰面積及化合物色譜峰數(shù)為指標，比較5個不同吸附時間對萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取時間對總峰面積和色譜峰數(shù)的影響Fig.3 The effect of extraction time on total peak area and chromatographic peak number

由圖3可知，隨著萃取時間延長，萃取物質(zhì)總峰面積隨之增加，吸附時間從10 min延長到30 min，總峰面積及檢測到的有效化合物個數(shù)增加較為明顯，之后增加幅度減小，趨于平衡，這是因為固相微萃取是一個吸附-解吸附的過程，30 min時基本達到平衡，此時間與GC-MS分析樣品所需時間較接近，可以提高單位時間內(nèi)樣品分析效率。

2.1.3 萃取溫度的選擇

萃取溫度是影響萃取效果很重要的因素，一方面溫度升高可以提高頂空固相微萃取的吸附效果，另一方面溫度超過合適范圍會引起萃取頭固有組分的解吸，使萃取頭的吸附能力下降，因此選取合適的萃取溫度尤為重要[10]。選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取時間為30 min的條件下，以總峰面積和檢出的色譜峰數(shù)為指標，比較不同萃取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對玫瑰醋揮發(fā)性成分萃取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 萃取溫度對總峰面積和色譜峰數(shù)的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on total peak area and chromatographic peak number

由圖4可知，萃取溫度升高時萃取量(總峰面積)有所增加，但萃取溫度升高到50 ℃以后，總峰面積增加比較平緩，但檢出有效化合物數(shù)量在減少。可能原因是過高的溫度引起一些物質(zhì)發(fā)生化學變化，故選擇萃取溫度50 ℃作為本次實驗的最佳溫度。

2.1.4 添加鹽濃度的選擇

適當加入NaCl等鹽類，可以增大溶液的離子濃度，同時減小液體對揮發(fā)性物質(zhì)的束縛，增大有機物質(zhì)的逸出活度，提高儀器的響應值及降低揮發(fā)性物質(zhì)的檢出限[11]，提高萃取時的吸附效率。選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，50 ℃萃取30 min的條件下，比較NaCl不同質(zhì)量濃度水平對萃取效果的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當NaCl質(zhì)量濃度從150 g/L增加到300 g/L時，檢測到的化合物種類呈增多的趨勢，增加到350 g/L時檢測到的化合物種類有所減少，可能原因是鹽濃度過高，與有機物發(fā)生反應。因此，調(diào)整樣品中NaCl質(zhì)量濃度為300 g/L較為合適。

圖5 鹽離子濃度對總峰面積和色譜峰數(shù)的影響Fig.5 The effect of NaCl concentration on total peak area and chromatographic peak number

2.2 SPME萃取方法的有效性驗證

采取上述優(yōu)化的操作條件(萃取時間30 min，萃取溫度50 ℃，NaCl濃度300 g/L)，對某玫瑰醋樣品萃取5次，分別進樣，選擇相對含量較大的多種香氣物質(zhì)，對其保留時間和相對含量進行重現(xiàn)性及方法回收率分析，結(jié)果見表1和表2。

表1 保留時間重現(xiàn)性結(jié)果Table 1 The results of retention time repeatability

表2 標樣的回收率實驗Table 2 The results of standard sample recovery experiment

結(jié)果表明，各香氣物質(zhì)保留時間的相對標準偏差RSD<1%，說明該香氣測定方法出峰時間較穩(wěn)定，實驗精密度高。方法回收率在83.32%～98.62%，樣品回收率能滿足測定要求。

2.3 浙江玫瑰醋中香氣物質(zhì)組成測定

2.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)進樣分析譜圖及定性分析

原料及其酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和成熟過程都可以產(chǎn)生浙江玫瑰醋的香氣成分[12]。經(jīng)1.3.1.2方法對樣品進行頂空固相微萃取預處理后，對1種傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋和1種初始酸度2.5 g/dL補料1/2體積的補料發(fā)酵玫瑰醋進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)進樣分析，傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋所得譜圖見圖6，補料發(fā)酵玫瑰醋所得譜圖見圖7。經(jīng)1.3.2對揮發(fā)性成分定性分析，得到色譜峰對應成分及相對峰面積，見圖8。

圖6 傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋GC-MS譜圖Fig.6 GC-MS spectrogram of traditional fermented rose vinegar

圖7 補料發(fā)酵玫瑰醋GC-MS分析譜圖Fig.7 GC-MS spectrogram of fed-fermented rose vinegar

圖8 補料與傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋的香氣物質(zhì)相對含量的比較Fig.8 Comparison of relative content of aroma components in fed-fermented and traditional fermented rose vinegar

由圖8可知，酸類、酯類、醇類是組成玫瑰醋香氣成分的主要物質(zhì)，占可檢出揮發(fā)性物質(zhì)含量的80%左右，補料發(fā)酵玫瑰醋的醇類和酚類物質(zhì)相對含量比傳統(tǒng)發(fā)酵低，而酯類、酸類、酮類、醛類成分的相對含量較傳統(tǒng)發(fā)酵醋樣高，酯類含量明顯高于傳統(tǒng)發(fā)酵，可能原因是黃酒醪液的加入促進了玫瑰醋發(fā)酵的酯類物質(zhì)生成，酯類物質(zhì)多，可以形成一種果香味。

2.3.2 玫瑰醋中香氣物質(zhì)組成分析

按照1.3.3香氣物質(zhì)定量方法，以計算出的相對校正因子對玫瑰醋中檢測的香氣成分進行定量分析，結(jié)果見表3。

表3 不同發(fā)酵工藝的玫瑰醋香氣成分定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of aroma components of rose vinegar with different fermentation process μg/L

續(xù) 表 μg/L

采用內(nèi)標法對不同發(fā)酵工藝玫瑰醋的香氣成分進行定量[13]，在保持原有香氣成分的基礎(chǔ)上，由于補料的加入，對風味的豐富有一定有利的影響，但補料發(fā)酵對玫瑰醋風味成分含量有較大的影響，主要有以下幾方面的變化：

(1)補料工藝對醇類的組成影響不大，但對其含量影響較大。傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋醇類主要組分為乙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇。補料工藝醋樣中乙醇占香氣總含量的0.13%，傳統(tǒng)發(fā)酵乙醇占0.26%，表明醋酸發(fā)酵比較徹底。β-苯乙醇在2種樣品中均大量存在，苯乙醇是苯丙氨酸經(jīng)降解產(chǎn)生醛，然后再還原生成的[14]。而β-苯乙醇具有清甜玫瑰香氣，氣味持久，不僅是組成黃酒的重要香氣成分，也對玫瑰醋的香氣貢獻較大，補料發(fā)酵降低了2,3-丁二醇的含量，但使其他高級醇的含量更為豐富，異丁醇、異戊醇、二異丁基甲醇含量也有提高，由于補料促進醋酸發(fā)酵，提高底料利用率，增加了醇類的合成反應。

(2)酯類的形成主要是微生物產(chǎn)生的酶系催化的有機酸和乙醇的酯化。補料發(fā)酵后玫瑰醋總酯含量比傳統(tǒng)發(fā)酵有所增加，在種類上比傳統(tǒng)工藝增加了2-乙基己酸乙酯、乳酸異戊酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸-2-苯乙酯這5種酯類成分，原因可能是補料可以促進對酯類物質(zhì)的生成，另外補料本身含有豐富的酯類物質(zhì)。酯類化合物的形成途徑主要是發(fā)酵和后熟的過程中有機酸和醇的酯化反應[15]，酯類的產(chǎn)生與乙醇的增加是同時進行的。由表3可知，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯是構(gòu)成玫瑰醋香氣的主要酯類成分，在傳統(tǒng)發(fā)酵中這3種成分占酯類含量的92.81%，補料發(fā)酵占79.17%。由于黃酒補液使補料發(fā)酵后玫瑰醋的辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯含量比傳統(tǒng)發(fā)酵提高，它們的含量增多使得改良后玫瑰醋的香氣更加馥郁芬芳[16]。

(3)補料發(fā)酵酸類比例達到所測香氣物質(zhì)總量的65.92%，而傳統(tǒng)發(fā)酵為51.83%。玫瑰醋的醋酸發(fā)酵主要生成乙酸和其他一些不揮發(fā)性酸，表明補料發(fā)酵提高乙酸生成量，除乙酸外，對其他酸類成分的提高也有影響。己酸和辛酸是醋酸發(fā)酵階段的產(chǎn)物，丙酸是酵母蛋白代謝的副產(chǎn)物[17]。而丙酸和正己酸在補料發(fā)酵中未檢出，可能是由于補料后使醋酸發(fā)酵效率提高，它們與部分醇類發(fā)生酯化的結(jié)果。

(4)醛、酮類物質(zhì)雖然在玫瑰醋香氣物質(zhì)組成中所占比例較小，但對浙江玫瑰醋風味有著重要影響，許多醛類作為玫瑰醋發(fā)酵過程中重要的底物和產(chǎn)物，都具有獨特的香味。由表3可知，組成玫瑰醋香氣成分的醛類主要是苯甲醛和呋喃甲醛，補料發(fā)酵后呋喃甲醛含量比傳統(tǒng)發(fā)酵提高93.53 μg/L，苯甲醛含量提高98.87 μg/L，含量變化較大。Callejon等的研究結(jié)果表明醋中3-羥基-2-丁酮的含量更多與醋酸發(fā)酵類型有關(guān)[18]。補料發(fā)酵將玫瑰醋中3-羥基-2-丁酮含量提高1053.10 μg/L，表明3-羥基-2-丁酮的含量可以用來鑒別玫瑰醋發(fā)酵工藝，補加酒液使其含量改變。

3 小結(jié)

采用固相微萃取(SPME)與GC-MS聯(lián)用測定玫瑰醋中香氣揮發(fā)性成分的組成及含量，優(yōu)化萃取條件使萃取的物質(zhì)濃度高，有效測定玫瑰醋中組成香氣的酯類、酸類、醇類、醛類、酚類等物質(zhì)，結(jié)果如下：

得到玫瑰醋香氣成分萃取條件為萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS，50 ℃條件下萃取30 min，樣品中添加鹽濃度300 g/L，此條件下萃取的玫瑰醋揮發(fā)性香氣物質(zhì)強度大，色譜分析響應值較高。方法回收率在83.32%～98.62%，能滿足實驗的要求。

補料醋樣除酯類物質(zhì)種類變化較大外，其余香氣組分種類與傳統(tǒng)工藝基本一致。乙醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇組成了玫瑰醋主要的醇類成分；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯是構(gòu)成玫瑰醋香氣的主要酯類成分；組成玫瑰醋香氣成分的醛類主要是苯甲醛和呋喃甲醛。

補液的加入使玫瑰醋香氣物質(zhì)的含量發(fā)生改變，大部分香氣物質(zhì)含量得到了較大提高，尤其是酯類、酸類、酮類的含量。補料發(fā)酵在種類上比傳統(tǒng)發(fā)酵增加了2-乙基己酸乙酯、乳酸異戊酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸-2-苯乙酯這5種酯類成分，由于黃酒補液使補料發(fā)酵后玫瑰醋的辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯含量比傳統(tǒng)發(fā)酵增多，使得改良后玫瑰醋的香氣更加馥郁芬芳。