程紅，任健，石嘉麗

(1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；4.東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院，哈爾濱 150030)

葵花11S球蛋白是葵花蛋白的主要組成成分，是決定其功能性質(zhì)的最主要因素?？ǖ鞍妆匦璋被岷控S富，氨基酸組成合理，是營養(yǎng)價值較高的蛋白質(zhì)，同時，葵花蛋白擁有較高的消化率和生物價?？ǖ鞍拙哂辛己玫奈托?、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化活力和乳化穩(wěn)定性等功能特性，很適合做工藝助劑和肉類制品的增量劑，適于乳化肉食系統(tǒng)，也可添加到奶制品、冰淇淋中，是食品工業(yè)理想的添加劑[1]。 但目前為止，葵花蛋白還沒有像大豆蛋白那樣得到廣泛應用，開發(fā)的葵花蛋白產(chǎn)品也很少。

熱處理是食品加工中一種經(jīng)常使用的加工手段，熱處理條件勢必對食品中蛋白等的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。本課題組前期已經(jīng)研究了熱處理對葵花11S 球蛋白溶解性、持水持油性、乳化性等功能性質(zhì)的影響[2]。本文將繼續(xù)探討熱處理過程中葵花11S 球蛋白的二級結(jié)構(gòu)、分子柔性以及氨基酸組成、粒徑分布等結(jié)構(gòu)性質(zhì)和理化性質(zhì)的變化，以期為葵花蛋白的應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

葵花籽:黑龍江齊齊哈爾地產(chǎn),市售；葵花11S 球蛋白：實驗室自制；胰蛋白酶：購于諾維信生物公司；甘氨酸：上海生工生物工程有限公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 主要設備儀器

J-815型圓二色譜儀 日本Jasco公司；Nano-ZS90型激光散射粒度儀 英國馬爾文公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日立公司；TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；FW80型萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葵花粕的制備

葵花籽→粉碎過40 目篩→石油醚脫脂→離心分離→干燥→脫脂葵花粕。

1.3.2 葵花11S 球蛋白的制備

采用鹽溶鹽析法，參考文獻[2]。

1.3.3 葵花11S 球蛋白的熱處理

將3份100 mL濃度70 g/L、pH值7.0的葵花11S球蛋白懸浮液分別置于三角瓶中，在磁力攪拌溫度分別為88，98，108 ℃條件下熱處理30 min，立即取出冰浴冷卻，冷凍干燥后備用。

1.3.4 圓二色譜(CD)

測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)參照Darewicz和Dziuba的方法[3]。配制濃度為0.15 g/L(pH值 7.0)的樣品，置于1 mm的比色皿中， 采用 J-815圓二色譜儀測試。具體條件：掃描速度為100 nm/min；檢測波長為190～240 nm；數(shù)據(jù)間隔為0.2 nm；帶寬為1.0 nm；反應時間為0.125 s。

1.3.5 分子柔性

采用胰蛋白酶法測定蛋白質(zhì)的分子柔性[4]。配制濃度為0.1%的蛋白質(zhì)溶液，取4 mL并向其中加入250 μL濃度為0.1%的胰蛋白酶溶液，置于37 ℃水浴鍋中反應5 min。蛋白質(zhì)消化結(jié)束后加入4 mL濃度為5%的TCA終止反應，置于離心機中以4000 r/min離心10 min，采用Folin-酚法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，采用凱氏定氮法測定總蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)分子柔性按下式計算：

1.3.6 氨基酸分析

蛋白質(zhì)樣品氨基酸組成參考Rahma等的方法測定[5]。稱取定量的蛋白質(zhì)樣品于水解管中，加入濃度為6 mol/L的HCl 溶液5 mL進行酸水解，充氮、封管，然后在110 ℃下水解24 h。水解后用pH 2.2的檸檬酸緩沖液定容過膜，采用氨基酸自動分析儀測定。

1.3.7 巰基和二硫鍵含量分析

巰基和二硫鍵含量測定方法及具體條件詳見參考文獻[6]。

1.3.8 粒徑分布

稱取30 mg蛋白質(zhì)樣品，用1 mL雙蒸水溶解后，在10000 r/min條件下離心10 min，測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量(Folin-酚法)。再用雙蒸水將蛋白質(zhì)樣品稀釋至0.3 mg/mL后在Nano-ZS90型激光散射儀上進行分析。光源為He-Ne，功率為10 mW，散射角度90°，波長633 nm，折射率為γ=1.332，測定溫度為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱處理改性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特性變化

2.1.1 圓二色譜(CD)分析

葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的圓二色譜圖測定結(jié)果見表1。

表1 葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)分布Table 1 Secondary structure distribution of sunflower 11S globulin and its heat treatment products

葵花11S球蛋白主要二級結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，經(jīng)88，98 ℃熱處理后，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量為0，β-折疊結(jié)構(gòu)稍有減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量略有增加，這說明在熱處理的過程中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)趨于無序。但是，108 ℃熱處理的蛋白質(zhì)卻出現(xiàn)了相反的規(guī)律，α-螺旋的百分含量顯著增加，這并不是α-螺旋結(jié)構(gòu)的復原，而是蛋白質(zhì)熱處理時產(chǎn)生了很多氨基酸殘基，氨基酸殘基之間相互作用形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[7]。

2.1.2 分子柔性

葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的分子柔性測定結(jié)果見圖1。

圖1 葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的分子柔性Fig.1 The molecular flexibility of sunflower 11S globulin and its heat treatment products

由圖1可知，88 ℃熱處理蛋白質(zhì)的分子柔性高于天然葵花11S球蛋白，隨著熱處理溫度升高，分子柔性下降顯著，并明顯低于天然蛋白質(zhì)。因為適當?shù)臒崽幚砜梢允沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，由穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成柔韌的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子柔性增強；同時熱處理作用能促使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露出來，巰基氧化成二硫鍵，增強了蛋白質(zhì)疏水性。但繼續(xù)升高熱處理蛋白質(zhì)的溫度，使蛋白質(zhì)表面的疏水鍵和共價鍵相互作用，發(fā)生嚴重的蛋白質(zhì)熱聚集現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)聚集體沉淀，沉淀的蛋白質(zhì)分子剛性增強，分子柔性減弱[8]。

2.2 熱改性產(chǎn)物的理化性質(zhì)變化

2.2.1 氨基酸分析

葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的氨基酸分布見表2。

表2 葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的氨基酸相對含量Table 2 Relative content of amino acids of sunflower 11S globulin and its heat treatment products %

由表2可知，葵花11S球蛋白中的必需氨基酸含量非常豐富，是很好的蛋白質(zhì)資源。熱處理時葵花11S球蛋白的氨基酸含量沒有發(fā)生顯著性變化，略微的差異可能是蛋白質(zhì)含量不同造成的。說明熱處理改變了蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)，發(fā)生肽鍵斷裂，氨基酸殘基側(cè)鏈變性或與其他分子發(fā)生結(jié)合。但蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列并沒有顯著性改變，氨基酸總量變化不大，沒有發(fā)生營養(yǎng)成分的流失，但它的吸收性可能會受到影響。

2.2.2 巰基和二硫鍵

本研究中暴露于蛋白質(zhì)表面的巰基稱為表面巰基，表面巰基和隱藏在蛋白質(zhì)分子里面的巰基稱為游離巰基。葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的巰基和二硫鍵含量見表3。

表3 葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的巰基、二硫鍵含量Table 3 The sulfhydryl，disulfide bond content of sunflower 11S globulin and its heat treatment products μmol/g

由表3可知，葵花11S球蛋白的游離巰基含量和表面巰基含量接近，說明11S球蛋白的游離巰基幾乎都暴露在蛋白質(zhì)分子的表面。11S球蛋白經(jīng)不同溫度熱處理后，表面巰基和游離巰基含量都明顯低于天然蛋白質(zhì)。隨著熱處理溫度的升高，表面巰基含量逐漸降低，當108 ℃熱處理后降低到最小值(1.78±0.15) μmol/g，游離巰基的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。相反，二硫鍵的含量卻呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這說明熱處理溫度低于熱變性溫度時，加熱可增強蛋白質(zhì)巰基活性，蛋白質(zhì)或多肽鏈相互靠近并發(fā)生聚集，巰基氧化，生成新的二硫鍵，導致巰基含量降低，二硫鍵含量升高。繼續(xù)升高熱處理溫度，二硫鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生部分游離巰基，使其含量有所升高；或是二硫鍵和疏水鍵等相互作用，導致蛋白質(zhì)產(chǎn)生嚴重的聚集，多數(shù)二硫鍵被包埋在了蛋白質(zhì)聚集體的內(nèi)部，造成二硫鍵的含量急劇降低[9]。

2.2.3 粒徑分布

加熱會使蛋白質(zhì)分子聚集情況發(fā)生改變，通過測量顆粒的粒徑，可以了解熱處理過程對蛋白分子大小和聚集情況的影響，葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的粒徑分布見圖2。

圖2 葵花11S球蛋白及其熱處理產(chǎn)物的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of sunflower 11S globulin and its heat treatment products

由圖2可知，葵花11S球蛋白的平均粒徑呈現(xiàn)高斯分布，而且平均粒徑較大(368 nm)，這表明11S球蛋白溶液體系狀態(tài)比較穩(wěn)定，粒徑分布較均勻。不同溫度熱處理的葵花11S球蛋白的粒徑分布發(fā)生了顯著變化，較原蛋白質(zhì)粒徑分布更分散。隨著熱處理溫度的升高，熱處理蛋白質(zhì)的粒徑先增大后減小。這說明低于熱變性溫度(88 ℃)熱處理的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展、松散，蛋白質(zhì)分子粒徑增大，產(chǎn)生了部分可溶的蛋白質(zhì)聚集體。熱處理溫度升高(98 ℃)，暴露的疏水鍵和共價鍵等相互作用，導致蛋白質(zhì)發(fā)生更多的聚集作用，粒徑繼續(xù)增大。但當熱處理溫度(108 ℃)更高時，蛋白質(zhì)聚集體會發(fā)生較嚴重聚集[10]，造成粒徑過大而形成蛋白質(zhì)沉淀，能溶解的蛋白質(zhì)則主要是解離的多聚體、亞基或多肽鏈，蛋白質(zhì)分子的粒徑反而減小。

3 結(jié)論

適當溫度熱處理使葵花11S球蛋白結(jié)構(gòu)伸展，由穩(wěn)定的α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為了柔韌的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)趨于無序，但一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列沒有顯著性改變，氨基酸總量沒有減少。蛋白質(zhì)分子柔性增強，分子平均粒徑增大，巰基氧化成二硫鍵，產(chǎn)生了部分可溶的蛋白質(zhì)聚集體。但過高溫度的熱處理，使蛋白產(chǎn)生了很多氨基酸殘基，氨基酸殘基之間相互作用形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)發(fā)生嚴重的熱聚集現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)聚集體沉淀，分子柔性減弱，剛性增強。溶解的蛋白質(zhì)則主要是解離的多聚體、亞基或多肽鏈，蛋白質(zhì)分子的粒徑反而減小，二硫鍵發(fā)生斷裂或是被包埋在了蛋白質(zhì)聚集體的內(nèi)部，造成二硫鍵的含量急劇降低。