滿麗莉,向殿軍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

2008年世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示，每年有1730萬人死于心血管疾病，占全球年死亡總數(shù)的30%。血栓形成是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。納豆激酶(nattokinase)是日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆在發(fā)酵過程中由納豆芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，其具有很強(qiáng)的溶解血栓功能并可激活體內(nèi)的纖溶酶原，活性是纖溶酶的4倍[1-3]，與目前臨床所用的鏈激酶、組織纖溶酶原激活劑、尿激酶等溶栓藥物相比，具有作用直接迅速、易被人體吸收、安全性好、藥效持續(xù)時(shí)間長、造價(jià)低廉、特異性高等優(yōu)勢(shì)，納豆激酶將是一種很有潛力的新型溶栓藥物[4-6]。

穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)酶的重要參數(shù)之一，決定其工業(yè)化應(yīng)用的可行性。納豆激酶的穩(wěn)定性好，有利于降低成本，提升酶的催化效率和底物溶解度、降低酶用量。隨著納豆激酶應(yīng)用范圍(如飼料、洗滌劑等)的不斷擴(kuò)大，納豆激酶在生產(chǎn)過程中需耐受不同的熱環(huán)境、pH環(huán)境、金屬離子、化學(xué)物質(zhì)等各種非自然條件，具有較好的穩(wěn)定性顯得尤為重要[7-10]。本研究綜合分析了納豆激酶對(duì)熱、pH、金屬離子、化學(xué)物質(zhì)、抑制劑和變性劑的穩(wěn)定性及傳代穩(wěn)定性，旨在為更合理地應(yīng)用和開發(fā)納豆激酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌MX-6(BacillussubtilisMX-6)：由中國豆豉中篩選鑒定獲得。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

試劑：凝血酶，購自中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原和瓊脂糖，購自美國Sigma公司；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CT型超凈工作臺(tái) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋 北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；BPH-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；Microfuge16型離心機(jī) 美國貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 德國Wiggens公司；DHP-600恒溫培養(yǎng)箱 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺 東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法及粗酶液制備

培養(yǎng)方法：挑取枯草芽孢桿菌MX-6接種于裝有50 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)12 h(OD600=1.5～1.6)。

粗酶液制備：將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2、160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)72 h，制備成納豆激酶粗酶液。

1.2.2 納豆激酶活力的測(cè)定

發(fā)酵液以5000 r/min離心10 min，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測(cè)定。納豆激酶活力的測(cè)定采用纖維蛋白平板法[11]，溶圈直徑采用電子游標(biāo)尺測(cè)定。

1.2.3 纖溶酶編碼基因aprN的擴(kuò)增及鑒定

根據(jù)GenBank中已公布的纖溶酶編碼基因aprN序列，應(yīng)用Primer軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-GTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTC-3'和下游引物：5'-TCCGGTGCTTGTGAAGATTTTCAGA-3'用于擴(kuò)增枯草芽孢桿菌MX-6中的aprN基因。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)序。利用NCBI中的Blast及MEGA 6.0分別進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 納豆激酶的耐熱性研究

粗酶液于-20，4，30，37，40，50，60 ℃分別處理1 h，以4 ℃的處理為對(duì)照，按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，確定溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.5 納豆激酶的pH穩(wěn)定性研究

粗酶液與Tris-HCl緩沖液按1∶1的比例混合，用0.2 mol/L NaOH將pH調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，以pH 7.2為對(duì)照，4 ℃放置1 h后按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，確定pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.6 金屬離子對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

粗酶液中分別加入不同的金屬離子(Mn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Hg2+、Ba2+)，終濃度為5 mmol/L，以不加金屬離子的粗酶液為對(duì)照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，確定金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.7 化學(xué)物質(zhì)對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

粗酶液中分別加入1%的牛血清蛋白、明膠、蛋白胨、丙二醇、乙醇、海藻酸鈉，以不加化學(xué)物質(zhì)的粗酶液為對(duì)照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，確定化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.8 抑制劑和變性劑對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

粗酶液中分別加入0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF(苯甲基磺酰氟)、1 mmol/L或10 mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、DTT(二硫蘇糖醇)、SDS(十二烷基硫酸鈉)，以不加抑制劑和變性劑的粗酶液為對(duì)照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，確定抑制劑和變性劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.9 納豆激酶的傳代穩(wěn)定性研究

將枯草芽孢桿菌MX-6在基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基斜面上連續(xù)傳代20次，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。將不同代次的菌株按照1.2.1的方法培養(yǎng)并制備粗酶液，按1.2.2的方法測(cè)定溶圈直徑，觀察不同代次的菌種產(chǎn)酶活性變化情況，確定納豆激酶的傳代穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖溶酶編碼基因aprN的擴(kuò)增及鑒定

以枯草芽孢桿菌MX-6的基因組DNA為模板，應(yīng)用aprN基因的特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得一條大小為1473 bp的特異性條帶(圖1)，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的枯草芽胞桿菌(CP017763.1、CP018184.1、CP014471.1)的aprN基因序列的同源性均達(dá)到99%以上，結(jié)果說明擴(kuò)增基因序列的正確性。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與納豆激酶E(WP 009966941.1)、納豆激酶NAT(WP 014479360.1)、納豆激酶前體(AA065246.1)聚合在同一分支上，表明枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的纖溶酶為納豆激酶(見圖2)。

圖1 枯草芽孢桿菌MX-6的aprN基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of aprN gene in Bacillus subtilis MX-6

圖2 枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與同源纖溶酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of plasminogen in Bacillus subtilis MX-6 and homologous plasminogens

2.2 納豆激酶的熱穩(wěn)定性

圖3 納豆激酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of nattokinase

由圖3可知，粗酶液在-20，30～50 ℃處理1 h，酶活性基本不變(P>0.05)，但60 ℃處理1 h，發(fā)生嚴(yán)重失活(P<0.01)，說明納豆激酶在30～50 ℃熱穩(wěn)定性較好。掌握納豆激酶的熱穩(wěn)定性關(guān)系到酶的保藏、進(jìn)入人體后的活性，該酶在人體溫度37 ℃左右、冷藏溫度4 ℃、冷凍溫度-20 ℃具有較好的穩(wěn)定性，具有開發(fā)為溶栓藥物的基本條件之一。

2.3 納豆激酶的pH穩(wěn)定性

圖4 納豆激酶的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of nattokinase

酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶的催化速度隨pH的變化而變化，不同的pH會(huì)影響帶電荷基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的穩(wěn)定性。由圖4可知，pH在3～11之間，酶活性相對(duì)穩(wěn)定，由于人體的胃腸道是酸性環(huán)境，枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的納豆激酶在酸性和堿性環(huán)境下均較為穩(wěn)定，具有開發(fā)為腸溶劑的廣闊前景。

2.4 金屬離子對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

圖5 金屬離子對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of metal ions on the stability of nattokinase

由圖5可知，Mg2+、Ca2+對(duì)納豆激酶的活性具有顯著的激活作用(P<0.01)，增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的主要原因可能有兩種：第一，可能與球蛋白的敏感部位結(jié)合，使酶的活性構(gòu)象或結(jié)構(gòu)更牢固；第二，可能屏蔽球蛋白表面的多余負(fù)電荷，消除其不利影響。K+、Fe2+對(duì)納豆激酶的穩(wěn)定性基本無影響(P>0.05)，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+對(duì)納豆激酶的穩(wěn)定性具有極顯著的抑制作用(P<0.01)，Hg2+導(dǎo)致納豆激酶完全失活，Zn2+和Hg2+的加入分別導(dǎo)致絮狀物和大量沉淀的形成。結(jié)果與相關(guān)報(bào)道存在差異，可能是由于菌株或酶的不同所導(dǎo)致的。

2.5 化學(xué)物質(zhì)對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

圖6 化學(xué)物質(zhì)對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of chemical substances on the stability of nattokinase

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，牛血清蛋白、明膠、蛋白胨、丙二醇、海藻酸鈉等有利于納豆激酶的穩(wěn)定性[12]，而納豆激酶工業(yè)化生產(chǎn)的后道工序是開放式的，易發(fā)生雜菌污染而導(dǎo)致酶的降解，有必要檢測(cè)某些防腐劑如乙醇對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。由圖6可知，牛血清蛋白、明膠、蛋白胨能夠顯著提高納豆激酶的穩(wěn)定性(P<0.01)，明膠>牛血清蛋白>蛋白胨，丙二醇、海藻酸鈉對(duì)納豆激酶的穩(wěn)定性基本無影響(P>0.05)，而乙醇顯著降低納豆激酶的穩(wěn)定性(P<0.01)。

2.6 抑制劑和變性劑對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，PMSF為典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑，0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF均可導(dǎo)致納豆激酶活性的完全喪失，說明枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的納豆激酶是一種絲氨酸蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的EDAT對(duì)納豆激酶的活性基本無影響(P>0.05)，表明枯草芽孢桿菌MX-6所產(chǎn)的納豆激酶不是一種金屬蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的DTT對(duì)納豆激酶的活性基本無影響(P>0.05)，進(jìn)一步說明納豆激酶結(jié)構(gòu)中無二硫鍵的存在。1 mmol/L的SDS不會(huì)抑制納豆激酶活性(P>0.05)，而10 mmol/L的SDS顯著降低納豆激酶的穩(wěn)定性(P<0.01)。

圖7 抑制劑和變性劑對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of inhibitors and denaturants on the stability of nattokinase

2.7 納豆激酶的傳代穩(wěn)定性

圖8 納豆激酶的傳代穩(wěn)定性Fig.8 The generation stability of nattokinase

由圖8可知，各代菌株所產(chǎn)納豆激酶活性之間的差異不顯著(P>0.05)，納豆激酶發(fā)酵表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳性能，其納豆激酶生產(chǎn)性能基本保持穩(wěn)定。說明納豆激酶生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌MX-6具備作為工業(yè)生產(chǎn)納豆激酶出發(fā)菌株的前提條件。

3 結(jié)論

納豆激酶具有成本低、活性高、可口服、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[13,14]。將納豆激酶開發(fā)成為口服溶栓藥物或腸溶劑，要求其具有良好的穩(wěn)定性，亦是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵之一?？莶菅挎邨U菌MX-6所產(chǎn)的納豆激酶在-20，4，30～50 ℃的熱穩(wěn)定性較好；pH在3～11之間酶活性相對(duì)穩(wěn)定；Mg2+、Ca2+對(duì)納豆激酶具有顯著的激活作用，K+、Fe2+對(duì)納豆激酶的穩(wěn)定性基本無影響，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+有顯著的抑制作用，Hg2+導(dǎo)致納豆激酶完全失活；牛血清蛋白、明膠、蛋白胨能夠顯著提高納豆激酶的穩(wěn)定性，丙二醇、海藻酸鈉對(duì)納豆激酶的穩(wěn)定性基本無影響，而乙醇顯著降低納豆激酶的穩(wěn)定性；PMSF可導(dǎo)致納豆激酶活性完全喪失，EDAT和DTT對(duì)納豆激酶的活性基本無影響，10 mmol/L的SDS顯著降低納豆激酶的穩(wěn)定性，納豆激酶活性具有良好的傳代穩(wěn)定性。相關(guān)研究顯示不同納豆激酶的穩(wěn)定性存在差異，這可能是由于所用菌株或發(fā)酵培養(yǎng)基及粗酶制備的方法不同造成的。準(zhǔn)確掌握納豆激酶的穩(wěn)定性有利于其生產(chǎn)、應(yīng)用及保藏。