李啟升，胡忠軍，李永吉 ，何 虎，韓燕青 ，靳 輝，李寬意 ，6*

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海201306；3.上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008；5.岳陽(yáng)市水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 岳陽(yáng) 414001；6.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院，北京 100049）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展、化學(xué)肥料使用量的增加以及人類生活污水的直接排放，河流湖泊等地表水的氮（N）、磷（P）元素污染日益嚴(yán)重[1]，過量N、P的輸入也被認(rèn)為是湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因[2-4]?？卦唇匚凼歉粻I(yíng)養(yǎng)湖泊能夠?qū)崿F(xiàn)生態(tài)修復(fù)的前提條件，大量研究表明削減外源P負(fù)荷是控源截污工作的重點(diǎn)[5-6]。然而，對(duì)于控N（削減外源N輸入）的必要性一直存在爭(zhēng)議。部分學(xué)者認(rèn)為控N會(huì)促進(jìn)固氮藍(lán)藻的生長(zhǎng)，其固氮作用會(huì)彌補(bǔ)外源N輸入的不足，使湖泊保持富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[7-9]。而其他學(xué)者則認(rèn)為N限制同樣廣泛存在于湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，藻類的固氮作用不足以抵消削減的外源N負(fù)荷，因此在控源截污工作中，N、P均需要控制[10-13]。目前，在我國(guó)的污水處理中，P仍是主要的削減指標(biāo)，尾水中的N濃度較高。例如，《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 18918—2002）的一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)中TP達(dá)標(biāo)排放濃度為0.5 mg·L-1，而TN達(dá)到15 mg·L-1。高N負(fù)荷的尾水排放到湖泊后，可能會(huì)導(dǎo)致湖泊水體較高的N濃度以及N∶P的失衡。

作為淺水湖泊的主要初級(jí)生產(chǎn)者之一，沉水植物在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，對(duì)于維持湖泊“清水態(tài)”具有重要的作用。例如沉水植物可以通過化感作用和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制浮游植物生長(zhǎng)[14]，能促進(jìn)水體懸浮顆粒物沉降，同時(shí)抑制沉積物再懸浮[15]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明水體中較高的N濃度是導(dǎo)致淺水湖泊沉水植物衰退的原因之一[16-18]。其機(jī)理主要有兩個(gè)方面：首先，高N濃度能夠抑制某些沉水植物的生理活性[19-20]。例如，Su等[21]的模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較高的氨氮濃度（＞10 mg·L-1）使水薀草（Egeria densa）葉片的氧化應(yīng)激和光合作用受到抑制，植物生長(zhǎng)受阻；其次，N濃度升高還能夠促進(jìn)浮游植物或植物表面附著藻類的生長(zhǎng)，從而降低沉水植物的光照可得性。例如，章宗涉[22]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著N等營(yíng)養(yǎng)鹽的持續(xù)輸入，水體中浮游植物迅速增長(zhǎng)，水體透明度下降，沉水植物的生長(zhǎng)率明顯降低。

苦草（Vallisneria natans）和穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）是長(zhǎng)江中下游流域常見的兩種沉水植物，苦草為蓮座型沉水植物（Rosette producer），葉基生，根系發(fā)達(dá)；而穗花狐尾藻為冠層型（Canopy pro?ducer），葉輪生[23]。在自然水體中，二者在營(yíng)養(yǎng)鹽和光照中存在著較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[24-26]。然而，在共存情況下，二者對(duì)水體N負(fù)荷升高的響應(yīng)還未見報(bào)道。基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)室外模擬實(shí)驗(yàn)，通過同株數(shù)混栽兩種沉水植物，探討外源N負(fù)荷升高（輸入N∶P從5∶1提高到100∶1）對(duì)兩種沉水植物生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

本實(shí)驗(yàn)于2017年8月21日至9月18日在中國(guó)科學(xué)院太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)周期為28 d。預(yù)先在太湖梅梁灣打撈足量沉積物，經(jīng)10目篩網(wǎng)過濾掉螺貝類后放入500 L的聚乙烯桶中，充分混勻后再分裝到每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中，每桶沉積物厚度為10 cm。實(shí)驗(yàn)桶為80 L藍(lán)色聚乙烯桶（高57 cm、頂部直徑45 cm、底部直徑36 cm）。實(shí)驗(yàn)用水同樣采集自太湖梅梁灣，經(jīng)64 μm浮游生物網(wǎng)過濾掉浮游甲殼動(dòng)物后，緩緩注入到每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中，保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶內(nèi)水面距桶頂部10 cm，因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶約含有57 L太湖水。實(shí)驗(yàn)用沉水植物提前半個(gè)月在太湖周邊河道中采集，種植在有沉積物和湖水的塑料箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，從塑料箱中挑選植株健康、長(zhǎng)勢(shì)良好、株高和生物量一致的苦草和穗花狐尾藻幼苗，采用同心圓的方式在每個(gè)聚乙烯桶內(nèi)間隔種植，每個(gè)桶中兩種植物各種植10株?？嗖莺退牖ê苍逯旮呔?5 cm，每個(gè)桶中苦草初始的平均總濕質(zhì)量為20.30 g，平均密度為184.55 g·m-2，穗花狐尾藻初始的平均總濕質(zhì)量為17.47 g，平均密度為158.82 g·m-2。每個(gè)聚乙烯桶中初始沉水植物的總密度為343.37 g·m-2。靜置5 d待水體澄清后開始實(shí)驗(yàn)，開始前測(cè)得桶內(nèi)水體的初始總氮（TN）濃度為（3.41±0.38）mg·L-1，總磷（TP）濃度為（0.180±0.015）mg·L-1，葉綠素a（Chla）濃度為（169.6±30.2）μg·L-1，主要藻類為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）（中國(guó)科學(xué)院太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)）。

本實(shí)驗(yàn)為單因素實(shí)驗(yàn)，N濃度為唯一變量，設(shè)兩個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)4個(gè)重復(fù)，共8個(gè)實(shí)驗(yàn)桶。其中低N組的N負(fù)荷設(shè)置為25 μg·L-1·d-1，高N組的N負(fù)荷設(shè)置為500 μg·L-1·d-1，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的P負(fù)荷與太湖日均P負(fù)荷相同，均為5 μg·L-1·d-1[27]。因此低N組和高N組的N∶P負(fù)荷輸入比分別為5∶1和100∶1，該比值在長(zhǎng)江中下游湖泊的TN∶TP范圍內(nèi)（何虎等，未發(fā)表數(shù)據(jù)）。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)配好營(yíng)養(yǎng)鹽后（氮源為KNO3，磷源為KH2PO4），每日早上8：00左右利用移液槍添加。實(shí)驗(yàn)期間不定期向桶內(nèi)補(bǔ)充蒸餾水以保證水位恒定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間，每7 d采集一次水樣，采樣時(shí)間為上午8：00—9：00。采樣時(shí)，用柱狀有機(jī)玻璃管（直徑為10 cm，高度100 cm）采集混合水樣，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定水體TN、TP、硝氮（NO-3-N）、氨氮（NH+4-N）、正磷酸鹽（PO3-4-P）和Chl-a濃度，測(cè)量方法依據(jù)《湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》[28]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第28 d），小心采集各桶內(nèi)所有的苦草和穗花狐尾藻植株。在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地內(nèi)清洗干凈，立即帶回實(shí)驗(yàn)室用濾紙吸干植物表面的水分，隨后測(cè)定兩種植物的株數(shù)和濕質(zhì)量，并計(jì)算生物量（濕質(zhì)量/面積）和相對(duì)生長(zhǎng)率（Relative growth rate，RGR）。相對(duì)生長(zhǎng)率計(jì)算公式為：

式中：Wi和Wf分別為植物實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后的濕質(zhì)量，g；D為時(shí)間，d[29]。

此外，我們從每個(gè)桶中隨機(jī)選取苦草和穗花狐尾藻各5株，測(cè)量苦草的葉片數(shù)、根長(zhǎng)、匍匐莖長(zhǎng)以及穗花狐尾藻的節(jié)間距、株高等一系列形態(tài)指標(biāo)，最后以5株植物的平均值代表該實(shí)驗(yàn)桶內(nèi)植物的形態(tài)數(shù)據(jù)。

營(yíng)養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量方差分析（rANOVA）進(jìn)行比較，兩種沉水植物的生長(zhǎng)指標(biāo)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)分析前利用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，如果數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)gX轉(zhuǎn)換，如果轉(zhuǎn)換后仍不滿足正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)

N負(fù)荷升高顯著提高了水體TN和NO-3-N濃度（圖1、表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高N組平均TN、NH+4-N、NO-3-N濃度分別是低N組的334%，102%和494%。

N負(fù)荷升高同樣對(duì)水體TP濃度和TN∶TP具有顯著的影響，表現(xiàn)為高N組TP和TN∶TP顯著高于低N組（圖1、表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高N組平均TP濃度和TN∶TP是低N組的261%和136%。N負(fù)荷升高對(duì)水體PO3-4-P濃度的影響不顯著（圖1、表1）。

N負(fù)荷升高顯著提高了水體Chl-a濃度（圖2、表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高N組的Chl-a濃度是低N組的619%。

表1 營(yíng)養(yǎng)鹽的重復(fù)測(cè)量方差分析Table 1 Repeated measurement analysis of variance of nutrients

2.2 苦草指標(biāo)

N負(fù)荷升高顯著影響了苦草的生物量、相對(duì)生長(zhǎng)率、葉片數(shù)、根長(zhǎng)、匍匐莖長(zhǎng)和株數(shù)（圖3、表2、表3）。低N組苦草的生物量、葉片數(shù)、根長(zhǎng)和株數(shù)分別是高N組的2.35、2.07、1.62倍和2.55倍，低N組苦草的相對(duì)生長(zhǎng)率（8.28 mg·g-1·d-1）顯著高于高N組（-23.27 mg·g-1·d-1），低N組苦草的匍匐莖長(zhǎng)（4.64 cm）同樣顯著高于高N組（無(wú)匍匐莖）（P＜0.05）。

圖1 低N組和高N組TN、NO-3-N、NH+4-N、TP、PO34--P濃度和TN∶TP的變化Figure 1 Difference of total nitrogen（TN），nitrate nitrogen（NO-3-N），ammonia nitrogen（NH+4-N），total phosphorus（TP），orthophosphate（PO34--P）content and the ratio of TN and TP between low nitrogen group and high nitrogen group

2.3 狐尾藻指標(biāo)

N負(fù)荷升高對(duì)穗花狐尾藻的生物量、相對(duì)生長(zhǎng)率、節(jié)間距、株高和株數(shù)的影響均不顯著（圖4、表2）。

2.4 總生物量

N負(fù)荷升高顯著影響了兩種沉水植物的總生物量（圖5、表2）。低N組沉水植物的總生物量（321.98 g·m-2）是高N組（115.86 g·m-2）的2.78倍。

3 討論

本研究通過室外模擬實(shí)驗(yàn)，探討混栽條件下兩種沉水植物（苦草和穗花狐尾藻）對(duì)N負(fù)荷升高的響應(yīng)。結(jié)果表明在28 d的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，較高的N負(fù)荷對(duì)苦草生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯脅迫作用（圖3），但是對(duì)穗花狐尾藻生長(zhǎng)沒有明顯的影響（圖4）。

圖2 低N組和高N組水體Chl-a含量的變化Figure 2 Differences of Chl-a content in water between low nitrogen group and high nitrogen group

表2 低N組和高N組的兩種沉水植物生長(zhǎng)和形態(tài)指標(biāo)的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 Independent sample T-test results of growth and morphological indicators of two submerged macrophytes in low-nitrogen group and high-nitrogen groups

圖3 兩個(gè)處理組苦草的生物量、相對(duì)生長(zhǎng)率、根長(zhǎng)、匍匐莖長(zhǎng)、株數(shù)和葉片數(shù)的變化Figure 3 Differences of biomass，relative growth rate，root length，stolon length，number of plants and number of leaves of V.natans between both treatments

以往的研究表明，較高的N濃度能夠從生理上直接抑制苦草的生長(zhǎng)[30]。例如，Cao等[31]的圍隔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦草根狀莖中游離氨基酸濃度隨著水體NH+4-N濃度的增加而逐漸上升，同時(shí)可溶性糖濃度降低，導(dǎo)致繁殖能力下降。潘琦等[32]發(fā)現(xiàn)隨著NO-3-N濃度在一定程度上增加，苦草的超氧化物歧化酶、丙二醛活性會(huì)升高，但是當(dāng)NO-3-N濃度繼續(xù)升高到40 mg·L-1時(shí)，苦草的抗氧化酶系統(tǒng)反而會(huì)受損，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻。在本實(shí)驗(yàn)中，高N組的TN和NO-3-N濃度均遠(yuǎn)高于低N組，較高的N濃度可能對(duì)苦草產(chǎn)生了生理上的抑制作用。另外，N負(fù)荷升高也可能通過刺激浮游植物生長(zhǎng)，從而間接抑制苦草的生長(zhǎng)[33]。Yu等[34]的原位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著水體TN濃度的上升，浮游植物Chl-a濃度也升高，同時(shí)水體光照下降，苦草的生物量、葉長(zhǎng)和根長(zhǎng)明顯降低。Kang等[35]的模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水體Chl-a濃度超過109 μg·L-1時(shí)，苦草的可溶性蛋白降低，丙二醛含量升高。黎慧娟等[33]發(fā)現(xiàn)浮游植物可以通過產(chǎn)生化感物質(zhì)來(lái)抑制苦草葉綠素的合成或分解其葉綠素從而抑制其生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，水體Chl-a濃度隨著N負(fù)荷升高而明顯上升，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)高N組平均Chl-a濃度達(dá)到了400 μg·L-1，浮游植物對(duì)苦草較強(qiáng)的遮光和化感效應(yīng)也可能抑制了高N組苦草的生長(zhǎng)。值得注意的是，本研究中高N組的TP濃度同樣顯著高于低N組（圖1、表1），這可能是富營(yíng)養(yǎng)水體中N負(fù)荷升高引發(fā)了生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)負(fù)反饋過程。即：高N負(fù)荷抑制了沉水植物的生長(zhǎng)，沉水植物的衰退反之又促進(jìn)沉積物中P的釋放，水體P濃度增加又進(jìn)一步促進(jìn)浮游植物的生長(zhǎng)以及沉積物P的釋放。He等[36]的模擬實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)高濃度N輸入促進(jìn)了沉積物的P釋放，從而提高了水體TP濃度。

圖4 兩個(gè)處理組穗花狐尾藻的生物量、相對(duì)生長(zhǎng)率、節(jié)間距、株高和株數(shù)的變化Figure 4 Differences of biomass，relative growth rate，internode length，plant height and number of plants of Myriophyllum spicatum between both treatments

圖5 兩個(gè)處理組沉水植物總生物量的變化Figure 5 Difference of total biomass of submerged macrophytes between both treatments

表3 低N組和高N組苦草根長(zhǎng)、匍匐莖長(zhǎng)和株數(shù)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Mann-Whitney U test results of root length，stem length and number of plants in low nitrogen group and high nitrogen groups

本研究中，高N組苦草的根長(zhǎng)顯著低于低N組，且未長(zhǎng)出匍匐莖及分枝，同時(shí)苦草葉片數(shù)也明顯少于低N組（圖3）。這表明N濃度升高對(duì)苦草地上和地下部分的生長(zhǎng)均具有不利的影響，同時(shí)限制了苦草的繁殖以及種群擴(kuò)張能力，這和Yu等[34]的原位實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為相似。類似地，張雪等[37]的模擬實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)隨著水體N負(fù)荷升高（從0～160 mg·m-2·d-1），刺苦草（V.spinulosa）根長(zhǎng)明顯下降，無(wú)性系分株呈下降趨勢(shì)。

本研究中，兩個(gè)處理組穗花狐尾藻的各項(xiàng)生長(zhǎng)和形態(tài)指標(biāo)均無(wú)顯著差異（表2），表明N負(fù)荷升高對(duì)穗花狐尾藻的影響不顯著。以往的研究表明，穗花狐尾藻對(duì)N具有較高的耐受性。例如，王愛麗等[38]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)水體NH+4-N濃度超過3.5 mg·L-1時(shí)，NH+4-N對(duì)穗花狐尾藻具有明顯的毒害作用，表現(xiàn)為體內(nèi)Chl-a和可溶性蛋白含量下降，脯氨酸含量上升。本研究中，高N組的平均NH+4-N濃度為0.29 mg·L-1，該濃度可能不足以對(duì)穗花狐尾藻產(chǎn)生生理上的抑制。此外，低N組中苦草對(duì)穗花狐尾藻的競(jìng)爭(zhēng)作用也可能抑制了穗花狐尾藻種群的發(fā)展，從而導(dǎo)致高N組和低N組之間穗花狐尾藻的差異不顯著。類似地，閔奮力等[25]的模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穗花狐尾藻與苦草共培養(yǎng)時(shí)，分枝數(shù)明顯減少。從沉水植物總生物量看，由于苦草生物量的降低，高N組沉水植物的總生物量明顯低于低N組（圖5、表2），同時(shí)N濃度升高還明顯促進(jìn)了浮游植物生長(zhǎng)（圖2、表1），表明N負(fù)荷升高加速了生態(tài)系統(tǒng)的草-藻轉(zhuǎn)換。

在湖泊的控源截污工作中，控P的必要性已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可，但對(duì)于控N仍存在較大爭(zhēng)議[5-13]。本研究結(jié)果表明N濃度升高會(huì)抑制沉水植物的生長(zhǎng)，進(jìn)而加快湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的進(jìn)程。因此，從湖泊管理和生態(tài)修復(fù)工作角度，本研究支持N和P均需要控制的觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

（1）N負(fù)荷升高對(duì)沉水植物的影響具有種間差異，較高的N濃度對(duì)苦草生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的脅迫作用，苦草的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著降低。但是N負(fù)荷升高對(duì)穗花狐尾藻的生長(zhǎng)影響不顯著，表明穗花狐尾藻對(duì)于高N濃度具有較高的耐受能力。

（2）N負(fù)荷升高顯著降低了沉水植物的總生物量，同時(shí)增加了水體Chl-a濃度，表明N負(fù)荷升高可能會(huì)有利于生態(tài)系統(tǒng)從草型清水態(tài)向藻型濁水態(tài)轉(zhuǎn)化。從湖泊管理和生態(tài)修復(fù)的角度而言，本研究支持N和P均需要控制的觀點(diǎn)。