郭賽賽，劉小妹，陳宏坤，莊志成，王宜志，唐景春，4*

（1.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300071；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，中國石油集團安全環(huán)保技術研究院，北京 102206；3.天津天邁節(jié)能設備有限公司，天津 300112；4.天津市城市環(huán)境污染診斷與修復工程技術中心，天津300071）

由于生物炭（BC）優(yōu)異的物理化學性質，包括巨大的表面積、大量的孔隙結構，其已被廣泛用于環(huán)境修復中。針對BC對微生物毒性影響的研究還未見報道，但有研究表明BC施于土壤后，會引起微生物群落的變化[1-2]。施用BC可以增加土壤養(yǎng)分和穩(wěn)定碳的含量[3-6]，從而為微生物提供更多的底物，提高微生物的豐度；BC在土壤中的應用也為微生物提供了一個安全的棲息地[7]。所以在經(jīng)過BC改良的土壤中，微生物的數(shù)量和活性會有所增加，這也導致土壤微生物群落和酶活性發(fā)生顯著變化[8]。但是BC對某種具體微生物的影響尚不清楚。Chen等[9]在中國桐鄉(xiāng)市進行了大田試驗，研究了稻草BC對土壤養(yǎng)分和微生物特性的影響，研究發(fā)現(xiàn)施用20%BC與對照相比，土壤細菌數(shù)量增加了26.9%；施用10%以上的BC，放線菌數(shù)量顯著增加80.6%～130%，但是真菌數(shù)量減少22.2%～30.2%，枯草桿菌數(shù)量減少42.4%～54.4%。另外Qiao等[10]在受砷污染的稻田土上進行實驗，發(fā)現(xiàn)BC增加了砷和鐵相關細菌的豐度，但對其他菌群的影響尚不清楚。

球磨生物炭（BM）是由高溫裂解后的BC在球磨機中通過機械力作用，將BC粒徑減小到納米或者微米級別的新型生物炭材料[11]。這種新型材料由Peter?son等[11]在2012年提出。由于它比BM具有更好地吸附[12]和降解[13]性能，而經(jīng)常被用于去除水體和土壤中的污染物。之前的研究證明了BM具有更大的比表面積[11]和更多的酸性官能團。近年來，關于BM的研究多集中在它的吸附降解性能[14]，很少有研究關注它對微生物的毒性。但是，根據(jù)以往的研究[15]，達到納米級別的BC很有可能對微生物產(chǎn)生毒性效應。另外，之前的研究[16-17]證明了碳納米材料都存在一定的毒性，如氧化石墨烯[18-20]、碳納米管[21]、富勒烯[22-23]等。

已有研究表明，自由基的產(chǎn)生是納米材料對微生物毒性作用的重要方式[24]。自由基或產(chǎn)生的活性氧可以與許多化學結構分子發(fā)生反應，包括生物大分子，如糖蛋白會導致細胞膜失穩(wěn)和細胞死亡。在水相中，這些自由基可以觸發(fā)活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，中、高濃度的ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死[25-27]，低濃度的ROS更廣泛的生理意義在于其對轉錄因子的激活以及對細胞增殖、分化的促進[25]。Lieke等[28]對500℃水稻秸稈BC研究發(fā)現(xiàn)，存在于BC中的自由基對線蟲神經(jīng)毒性產(chǎn)生影響。此外，Liao等[29]和Farhangi-Abriz等[30]證明了BC顆粒中的自由基在水中可以促進活性氧的產(chǎn)生，并對植物的種子萌發(fā)以及根和莖伸長產(chǎn)生不利的影響。BM經(jīng)球磨后，材料粒度大幅降低，部分可以達到納米尺度，因此有理由認為BM有一定程度的納米毒性效應。

到目前為止，關于BM對細菌的毒性影響尚未有人研究?；诖?，本研究以小麥秸稈為原料，在500℃下制備得到BM，通過行星式球磨儀制備球磨生物炭材料。對其性質進行研究，同時選取兩種模式細菌進行急性毒性實驗，利用熒光法測定細菌的ROS和存活率等指標，并利用掃描電子顯微鏡（SEM）和激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察細菌的形態(tài)，對BM的微生物毒性和抗菌機理進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

實驗所用的生物炭原料為小麥秸稈，來源于天津周邊農(nóng)村。BC由小麥秸稈在馬弗爐中500℃限氧裂解2.5 h制備而成[31]，BM由生物炭按照Lyu等[14]的方法制備而成。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923為實驗室保存菌種。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1），在 30 ℃、180 r·min-1條件下，于搖床中培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期。

1.2 BC的表征

對制備的BC和BM進行清洗處理：將BC和BM置于蒸餾水中浸泡一周，并用磁力攪拌器（84-B，山東菏澤正虹科教儀器有限公司，中國）攪拌，每隔6 h倒掉漂浮在水面上的雜質，再加入等量的蒸餾水進行清洗。將清洗好的BC和BM進行抽濾，置于恒溫干燥箱（DGG-9023A，上海優(yōu)浦科學儀器公司，中國）中，于80℃下干燥24 h，裝入塑封袋密封，備用。采用多站擴展式全自動快速比表面儀（ASAP 2460，麥克公司，美國）測定BC和BM的比表面積；采用掃描電子顯微鏡（JSM-7800F，日本電子，日本）觀測BC和BM的表面形貌；采用傅里葉變換紅外光譜儀（TEN?SOR 37，BRUKER，德國）分析BC和BM的官能團；采用pH計（PB-10，Sartorius，德國）測定pH值；采用電導率儀[FE30，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，中國]測定電導率值。

1.3 急性毒性實驗

將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的E.coli和S.aureus轉移至50 mL無菌離心管中，5000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，用無菌0.9%NaCl清洗3次以除去殘留的LB培養(yǎng)基。將清洗完的菌種倒入50 mL分別加入了0、10、20、50、100、200 mg·L-1BC和BM的無菌LB培養(yǎng)基和0.9%NaCl中，置于搖床（HNY-2102C，歐諾公司，中國）里，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)2.5 h后，分析其毒性影響。

1.4 細菌形貌觀測

取50 mL染毒后的菌液，5000 r·min-1離心5 min后，去除上清液。將菌體放到2.5%的戊二醛（掃描電鏡專用）中，4℃固定4 h（或固定過夜）。將固定液倒掉，0.1 mol·L-1PBS緩沖液（pH7.0）漂洗3次，每次15 min。利用濃度為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇進行梯度脫水，每次15 min，隨后用無水乙醇處理兩次，每次20 min。真空干燥后在菌體表面噴金，置于SEM下觀察細胞形態(tài)。

1.5 細菌存活率測定與LSCM觀測

存活率采用細菌細胞活性測定試劑盒（Invitro?gen，美國）測定[24]。染料為PI和SYTO 9，PI只能穿過破損的細胞膜，與細胞核結合顯紅色熒光；SYTO 9可以穿過所有細胞膜，與細胞核結合顯綠色熒光。當兩種染料同時存在時，活細胞呈現(xiàn)綠色，死細胞呈現(xiàn)紅色。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，用無菌0.9%NaCl清洗3次，取100 μL PI和SYTO 9等量混勻后的染料與100 μL菌液混合，錫箔紙包好后置于搖床中，于30℃，180 r·min-1混合搖勻15 min，取100 μL樣品于96微孔板中，用全功能酶標儀（Synergy H4，伯騰公司，美國，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長521 nm）測定熒光值，計算存活率。另取50 μL樣品用LSCM（LSM880 with Airyscan，Zeiss公司，德國）觀測。

1.6 細菌ROS測定

用活性氧試劑盒（碧云天，中國）測定細菌細胞內的ROS含量[24]，染料為2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）。DCFH-DA向細胞內擴散，脫去乙?；蔀椴伙@熒光的DCFH，細胞內的ROS迅速將DCFH氧化成具有高強度熒光的DCF，其熒光強度和細胞內的ROS含量成正比。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，用無菌0.9%NaCl清洗3次后，取100 μL活性氧染料與100 μL菌液混合，錫箔紙包好后置于搖床中，于30℃、180 r·min-1混合搖勻30 min，取100 μL樣品于96微孔板中，用酶標儀（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長521 nm）測定熒光值。相對ROS水平表示為樣品組與空白對照組的熒光強度之比[26]。

消除ROS實驗：將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體清洗干凈后，倒入50 mL 0.9%NaCl中，并加入2 mmol·L-1N-乙酰半胱氨酸（NAC）[32]。以不加NAC的0.9%NaCl為對照，30℃條件下培養(yǎng)1 h后，向加入NAC的培養(yǎng)瓶中依次加入0、10、20、50、100、200 mg·L-1的BM，培養(yǎng)2.5 h后，測定各體系的致死率和ROS含量，并在LSCM和SEM下直觀觀察細胞的損傷情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理及作圖，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，ROS和存活率的測定均設置3次平行，采用SPSS對數(shù)據(jù)進行方差分析（One way ANO?VA）及Turkey′s Test分析，P＜0.05表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 BM和BC的性質

BM和BC的基本性質見表1。分析表1可知，BM的比表面積遠大于BC，是BC的3.15倍，而pH值低于BC。由表1中的元素分析結果可知，BM中C和O的含量高于BC，這與BM溶液比BC溶液的顏色黑這一實驗現(xiàn)象相吻合。將BM和BC置于蒸餾水中，超聲30 min后，BC在10 min內上浮或者沉淀，而BM在12 h內未發(fā)生沉淀，說明BM的穩(wěn)定性和分散性優(yōu)于BC。

表1 BM和BC的比表面積、pH和元素組成Table 1 Specific surface area，pH and elemental composition of BM and BC

用掃描電子顯微鏡對BM和BC的顆粒大小和形態(tài)進行比較的結果見圖1。由圖1a和圖1b可知BC是多孔的，存在明顯的孔狀結構，粒度為毫米級別，孔徑約為1 μm。由圖1c和圖1d可知，BM的粒徑不規(guī)則，且大小不均勻，但都在1 μm以下，圖中圈出的紅色部分為小于100 nm的顆粒?？傮w來看，BM的粒度在60 nm～1 μm之間。BC經(jīng)過球磨成BM后，顆粒粒徑減小，顆粒數(shù)量大量增加，這導致了比表面積的增加，與比表面積的結果一致。

圖1 BM和BC的掃描電鏡圖Figure 1 Scanning electron microscopy（SEM）of BM and BC

從BM和BC的紅外圖譜（圖2）可以發(fā)現(xiàn)，BM在3356 cm-1和3048 cm-1處，O-H和N-H鍵顯著拉伸，C=C、N=N、C=N和N=O雙鍵在1586 cm-1處伸縮振動，C-H在873、810 cm-1和749 cm-1處彎曲振動。此外，在BM上觀察到兩個新的峰，分別為1380 cm-1和1092 cm-1處的酚醛C-X和C-O，表明球磨引入了一些酸性官能團，這與pH值的結果相一致。在測試條件下，BM表面酸性官能團的引入會增強電雙層之間的排斥力，以防止亞微米球磨生物炭粒子的聚集，這與超聲分散的結果一致。

圖2 BM和BC的紅外圖譜Figure 2 Fourier transform infrared（FTIR）of BM and BC

2.2 添加BM和BC對E.coli和S.aureus存活率的影響

經(jīng)過2.5 h的毒性暴露實驗后，E.coli和S.aureus的存活率測定結果如圖3所示。在0.9%NaCl中，僅添加10 mg·L-1的BM，S.aureus的存活率為90.1%，當濃度增大到200 mg·L-1時，存活率僅為23.5%；而添加10 mg·L-1的BC時，S.aureus的存活率為98.2%，當濃度增大到200 mg·L-1時，存活率仍為68.9%。這說明相比于BC，BM對S.aureus的毒性更顯著。在LB培養(yǎng)基中，BM濃度為200 mg·L-1時，S.aureus存活率為60.9%，這說明在LB培養(yǎng)基中，BM對S.aureus的毒性減弱。無論是在0.9%NaCl還是LB培養(yǎng)基中，添加BM和BC后，E.coli的存活率一直維持在90%以上，且兩者差別較小，這說明BM和BC對E.coli的存活率影響不顯著。由SPSS分析，數(shù)據(jù)對照均具有顯著性差異。

2.3 添加BM和BC對E.coli和S.aureus氧化損傷的影響

為了分析BM和BC對E.coli和S.aureus產(chǎn)生毒性的原因，測定了兩種菌細胞內的ROS含量，結果如圖4所示。細菌和培養(yǎng)介質相同的條件下，添加BM產(chǎn)生的ROS是BC的1.1～2.0倍。如圖4a所示，在0.9%NaCl中，添加BM對E.coli最大的氧化損傷為空白的1.4倍，對S.aureus的氧化損傷最大為空白的6.4倍，且倍數(shù)隨著BM濃度的增加而增加，說明BM對S.aureus造成的氧化損傷遠大于E.coli。如圖4b所示，在LB培養(yǎng)基中，添加BM對E.coli最大的氧化損傷為空白的1.2倍，對S.aureus的氧化損傷為空白的4倍。對比圖4a和圖4b可以發(fā)現(xiàn)，在LB培養(yǎng)基中，添加BM和BC后，細菌細胞內的ROS均有所減少。

圖3 0.9%NaCl和LB培養(yǎng)基中細菌的存活率Figure 3 Livability of bacteria in 0.9%NaCl and LB medium

圖4 0.9%NaCl和LB培養(yǎng)基中細菌產(chǎn)生的ROSFigure 4 ROS produced by bacteria in 0.9%NaCl and LB medium

2.4 BM對S.aureus產(chǎn)生毒性的機理探究

2.4.1 NAC對S.aureus產(chǎn)生ROS與存活率的影響

由于BM對E.coli的毒性效果不明顯，因此以S.aureus為模式菌株探究BM毒性與氧化損傷的關系。

如圖5所示，加入NAC后，各處理組ROS的含量降低至與空白相接近，說明各組中ROS的作用已基本消除。與暴露于BM的各組相比，加入的NAC使得S.aureus存活率升高，但是與對照相比仍有一定差距。說明BM對S.aureus產(chǎn)生毒性主要是由于氧化損傷導致的，但是其他因素，例如BM的機械碰撞作用也有可能是造成毒性的一個原因，因此雖然消除了ROS，但其存活率與對照相比仍有一定差距。

2.4.2 E.coli和S.aureus的LSCM圖像

為進一步證實上述推測，采用熒光活/死染色法觀察細菌膜完整性，區(qū)分活菌（綠色）和死菌（紅色），以探討B(tài)M和BC對E.coli和S.aureus的抗菌能力。選取在0.9%NaCl中，添加BM后的E.coli和S.aureus的LSCM圖像進行分析。如圖6所示，在0.9%NaCl中，不添加BM時，E.coli和S.aureus幾乎全為綠色，添加BM后，E.coli和S.aureus中均有紅色出現(xiàn)，且紅色部分所占比率和BM的濃度呈正相關。同一濃度下，S.aureus中紅色部分遠大于E.coli，說明BM對S.aureus的毒性遠大于E.coli。在0.9%NaCl中添加200 mg·L-1BM，消除ROS后S.aureus的LSCM圖像（圖6d）與未消除ROS的圖像（圖6c）相比，紅色部分大量減少，說明加入NAC后，S.aureus的存活率上升。

2.4.3 E.coli和S.aureus的SEM圖像

為了進一步確定實驗結論，采用SEM觀察了E.coli和S.aureus的表面形態(tài)。選取在0.9%NaCl中，添加BM后E.coli和S.aureus的SEM圖像進行分析，如圖7所示：不添加BM的S.aureus表面光滑，無褶皺存在。添加BM后，S.aureus的表面存在褶皺，且隨著BM濃度的增加，褶皺更加明顯?？赡苁怯捎贐M造成S.aureus細胞膜和細胞壁損傷，細胞質泄漏所致；不添加BM的E.coli表面光滑無破損，添加BM后，細胞表面存在微量的褶皺，但是隨著濃度增加，細胞體積不變。說明在0.9%NaCl中，BM對S.aureus的毒性遠大于E.coli。在LB培養(yǎng)基中也有相似情況，但沒有在0.9%NaCl中明顯。在0.9%NaCl中添加200 mg·L-1BM，消除ROS后S.aureus的SEM圖像（圖7d）與未消除ROS的圖像（7c）相比，褶皺大量減少，細胞膜基本無褶皺。這與ROS、存活率和LSCM的結果吻合。

圖5 0.9%NaCl中S.aureus產(chǎn)生的ROS與S.aureus的存活率Figure5 ROS produced by S.aureus and livability of S.aureus in 0.9%NaCl

圖6 在0.9%NaCl中添加BM后細菌的LSCM圖像（×40倍）Figure 6 LSCM image of bacteria in 0.9%NaCl after adding BM（×40 times）

加入NAC消除ROS的實驗說明氧化損傷是造成細胞死亡的重要原因，但是其他因素，例如納米顆粒對細胞的機械碰撞等也有可能是造成BM毒性的原因。

3 討論

本次研究的實驗結果表明，相比于BC，BM具有更低的pH值，更多的酸性官能團，更大的比表面積，這與Lyu等[14]和Wang等[33]的研究結果一致。球磨能夠將毫米尺度的顆粒減小到納米級別，由于顆粒減小，BM在蒸餾水中分散得更好。同時，也由于顆粒減小使大量亞微米顆粒增加，從而導致了BM比表面積的增加。FTIR結果表明，BM具有更多的酸性官能團，從而導致pH值的降低。

對比BC和BM，相同條件下，BM的毒性更明顯。BM由BC經(jīng)過球磨得到，通過球磨，可能會增加持久性自由基的數(shù)量[34-35]。本次研究中，相比于LB培養(yǎng)基，BM在0.9%NaCl中對S.aureus的毒性更明顯，可能是由于LB培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質起到了緩沖與保護作用，這與Liu等[24]的研究結果一致。在兩種介質中，BM的毒性都大于BC。這除了與自由基有關，可能還與顆粒尺寸有關。由圖1可知，BM的粒度在60 nm～1 μm之間，遠小于BC[36]，而S.aureus的直徑在0.8 μm左右，小于100 nm的顆粒極有可能穿過細胞的細胞膜，進入細胞，造成高濃度的ROS，從而導致S.aureus的死亡。100 nm～1 μm之間的顆粒，由于培養(yǎng)過程中的振蕩作用，會對S.aureus產(chǎn)生撞擊，從而造成一定的機械損傷。由于粒度減小，導致BM具有更大的比表面積[33，37]，與 E.coli和 S.aureus的接觸更充分，使其產(chǎn)生更高濃度的ROS，所以損傷更大。此外，BM對E.coli和S.aureus的毒性效應不同，可能還與E.coli產(chǎn)生的胞外聚合物（EPS）有關。由于革蘭氏陽性菌與陰性菌的細胞壁構造不同，在其表面產(chǎn)生的EPS也不同[38]。EPS不僅可以起到屏障作用，防止生物炭所造成的物理損傷，而且還可以作為ROS的匯，保護細菌免受生物炭的毒害[39]。

圖7 在0.9%NaCl中添加BM后細菌的SEM圖像（×40 000倍）Figure 7 SEM image of bacteria in 0.9%NaCl after adding BM（×40 000 times）

4 結論

（1）球磨生物炭具有更多的酸性官能團和更大的比表面積。

（2）球磨生物炭對E.coli和S.aureus的毒性影響遠大于生物炭。

（3）球磨生物炭對S.aureus的毒性高于E.coli，且毒性與濃度呈正相關。