馬月花 郭曉瑞 楊 楠 張 野 唐中華 王洪政

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

鎘(Cd)是植物的非必需元素，也是毒性最強的重金屬污染物之一。目前，由于采礦、冶煉、垃圾焚燒以及含Cd肥料的過量使用，土壤環(huán)境面臨著巨大的Cd污染危機[1]。據統(tǒng)計，我國土壤中度和重度鎘污染點位超標率為1%[2]。Cd對植物的毒害通常表現為根系和地上部生長受阻、水分和養(yǎng)分吸收受到抑制、生理代謝紊亂，并最終導致植物產量下降甚至引起植物死亡[3～4]。更為重要的是，鎘容易積累在植物中進而通過食物鏈進入人體，對人體健康造成巨大威脅[5]。

在面對Cd脅迫的過程中，植物也進化出了多種應對Cd脅迫的耐性機制。目前，國內外學者一般都將植物對Cd毒害的耐性機制概括為兩類：避性機制和耐性機制[6～7]。避性機制主要是指植物通過根系以及根際微生物的分泌物等對周圍的Cd2+進行螯合降低其毒性、或通過限制Cd2+的跨膜吸收減少進入植物體內Cd的數量[8～10]。耐性機制則是指植物體內進化出特定的機制來減緩進入植物體內的Cd對植物生長發(fā)育造成的危害，如Cd2+的區(qū)域化、將Cd2+螯合至無毒狀態(tài)、提高抗氧化活性避免引起次級傷害等[11～12]。一般來說，一種植物可能會具有不止一種的耐性機制，以提高其對Cd脅迫的抵抗能力。

黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge)是我國有名的傳統(tǒng)藥用植物，其干燥后的根莖中含有黃酮、皂苷和多糖等多種活性成分，具有補氣固表、利尿排膿、斂瘡生肌的功效[13]。雖然目前黃芪的主產區(qū)還未出現嚴重的土壤Cd超標情況，但是隨著北方土壤中含Cd農藥和化肥的過量使用以及工業(yè)排放的增加，黃芪主產區(qū)的土壤也已處在Cd污染的威脅之下。已有調查結果顯示，不同產區(qū)黃芪中藥材樣品中已出現不同程度的Cd超標情況：山西29.41%、內蒙古25%、黑龍江7.65%、甘肅13.16%[14]。因此，研究Cd對黃芪生長發(fā)育的影響并探討黃芪對Cd脅迫的耐性機制具有重要的理論和實踐意義。

本研究擬以黃芪幼苗為材料，在水培條件下研究不同程度Cd脅迫對其生長形態(tài)、礦質元素吸收轉運、次生代謝物質合成等的影響，并研究黃芪對Cd的吸收和積累情況，以期在生理水平上探討得到黃芪對Cd的耐性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膜莢黃芪(A.membranaceus(Fisch.) Bunge)種子購自河北省安國市元泰藥用植物種子站。黃芪皂苷Ⅰ-Ⅳ(Astragaloside Ⅰ-Ⅳ)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、毛蕊異黃酮苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)、刺芒柄花素(Formononetin)和刺芒柄花苷(Ononin)標準品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級甲醇和乙腈購于北京百靈威化學有限公司；K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、Cd的標品購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；去離子水(電阻率高于18.2 MΩ·cm-1)取自Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪幼苗培養(yǎng)及Cd處理

黃芪種子用10%(v/v)次氯酸鈉浸泡2 min消毒并用自來水沖洗3 min后，在蒸餾水中吸脹12 h，然后播種于濕潤的蛭石中。待黃芪子葉出土并長至4～5 cm高時，選擇長勢一致的幼苗移栽至盛有Hoagland營養(yǎng)液(pH5.5)的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所有培養(yǎng)實驗均在植物培養(yǎng)室中進行，條件為：溫度為30℃/20℃(白天/黑夜)，白天時間為14 h，光照強度為400 μmol·m-2·s-1，相對濕度保持在60%～70%。水培3周后對黃芪幼苗進行Cd處理，處理時培養(yǎng)液中加入CdCl2溶液并使其終濃度達到25、50、100、200 μmol·L-1。每個處理設3個重復，每個重復包括10株幼苗。處理時間為7 d，期間每2 d更換處理液。處理結束后進行各指標的測定。

1.2.2 幼苗伸長抑制率及生物量測定

在處理前后用直尺(精度為1 mm)分別測定植株地上部的高度和根系長度，伸長生長抑制率計算如下：

(1)

處理結束后，將幼苗從根莖結合處分開，吸干表面水分后分別稱重(鮮重)，110℃殺青10 min后60℃烘干至恒重并稱重(干重)。

1.2.3 光合色素和丙二醛含量的測定

取黃芪幼苗植株頂端第二葉序的葉片，按照張憲政的方法[15]測定葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素的含量。

地上部和根系丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行測定[16]。

1.2.4 植物中金屬元素含量的測定

處理結束后，收獲黃芪幼苗根系和地上部，并將地上部分為頂部、中部和基部3個部分。用去離子水將各部分沖洗干凈后80℃烘干。將烘干樣品磨碎后，準確稱取0.300 g放入消煮管中，并加入10 mL硝酸—高氯酸混合液(v/v=5∶1)進行消煮。消煮結束后消煮管內加入5 mL 2%(v/v)硝酸并溫浴后轉移至25 mL容量瓶中，用2%硝酸溶液進行定容。

溶液樣品中金屬元素的含量使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES Optima 8000)進行測定，其具體含量由各元素標準曲線計算得出。

1.2.5 次生代謝物質含量的測定

取黃芪幼苗根部干樣0.50 g，加入80%乙醇10 mL超聲提取45 min(100 Hz，40℃)，過濾后將殘渣再用10 mL溶劑提取一次，合并兩次提取液。使用真空離心濃縮儀將提取液濃縮至干，用1 mL甲醇復溶樣品，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱中備用。

樣品中黃芪皂苷和類黃酮的含量使用超高效液相色譜—質譜聯(lián)用儀進行測定，具體色譜和質譜條件等按照楊楠等的方法[17]進行。

1.3 數據處理

文中所列數據均為3次重復的平均值，用SPSS統(tǒng)計軟件(19.0，IBM)對實驗數據進行統(tǒng)計分析，并采用SigmaPlot軟件(14.0，Systat Software)作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd處理對黃芪幼苗生長的影響

Cd處理顯著抑制了黃芪幼苗根系和地上部的伸長生長，且根系對Cd處理的反應更為敏感，因為地上部在50 μmol·L-1Cd處理下才出現明顯的生長抑制，而根系在25 μmol·L-1濃度時即表現出明顯生長抑制。此外，根系和地上部生長抑制率均隨著Cd處理濃度增加顯著上升，但相同處理濃度下根系生長抑制率明顯高于地上部，經擬合計算得知根系和地上部的IC50分別為62和248 μmol·L-1(圖1)。與伸長生長相同，在Cd處理下，特別是較高濃度Cd處理下，黃芪幼苗地上部和根系的鮮重及干重也明顯低于對照。

Cd處理引起了黃芪幼苗新生葉片明顯變黃，經測定發(fā)現第二葉序葉片中葉綠素a、b、總葉綠素及類胡羅卜素的含量在較低濃度Cd下就比對照降低了50%左右(圖1)。雖然光合色素的含量隨著Cd濃度的升高有繼續(xù)降低的趨勢，但是不同處理濃度間的差異遠遠小于Cd處理與對照之間的差異。除葉片變黃外，Cd處理還使得黃芪幼苗根系的顏色由白色變?yōu)榱俗厣?圖1)，說明處理后黃芪根系表皮細胞受到傷害。MDA含量測定的結果顯示，50 μmol·L-1Cd處理引起了黃芪幼苗根系MDA含量的明顯升高。Cd處理雖然也提高了黃芪幼苗地上部MDA的含量，但是其影響程度遠低于根系。

2.2 黃芪幼苗生長對Cd的吸收和區(qū)域化

隨著Cd處理濃度的升高，地上部和根系的Cd含量逐步升高，并且其含量均與處理濃度之間呈現出良好的正相關關系。在不同濃度Cd處理下，黃芪幼苗根系的Cd含量始終遠遠高于地上部，最高可達地上部的13倍(圖2)。從Cd轉移系數(TF)結果來看，低Cd處理下黃芪幼苗Cd的TF值僅為0.055，雖然隨著Cd處理濃度的升高TF值也有所升高，但是在200 μmol·L-1Cd處理下TF值也僅為0.157。

除此之外，我們還發(fā)現在所有Cd處理中地上部基部的Cd含量始終維持最高，中部Cd含量次之，而頂端Cd含量最低(圖2)。當Cd處理濃度為200 μmol·L-1時，地上部基部Cd含量分別為中部和頂端的1.5和2.9倍。

2.3 Cd處理對黃芪幼苗礦質元素吸收和轉運的影響

黃芪幼苗根系礦質元素的吸收受到了Cd處理的嚴重影響(圖3)。Cd處理降低了根系中K、Ca、Zn、Mn的含量，特別是K，其含量在200 μmol·L-1Cd處理下比對照下降了46.2%。與上述4種元素的情況相反，根系中Mg、Fe和Cu的含量則受Cd處理的影響而增加，并且其增加程度隨著Cd處理濃度的升高而升高。

圖1 不同濃度Cd處理對黃芪幼苗生長的影響 所有實驗進行了3次重復，誤差線代表標準誤差。下同。Fig.1 Effect of different Cd treatments on the growth of A.membranaceus seedlings All experiments were performed in triplicate,and error bars represent SE.The same as below.

圖2 黃芪幼苗對Cd的吸收和轉運Fig.2 The adsorption and translocation of Cd in A.membranaceus seedlings

圖3 Cd對黃芪幼苗礦質營養(yǎng)元素吸收和轉運的影響 部位1～4依次為根系、地上部頂端、地上部中部和地上部基部。Fig.3 The effects of Cd treatments on adsorption and translocation of mineral elements in A.membranaceus seedlingsPartment 1-4 are root,upper shoot,middle shoot and basal shoot.

與根系不同，Cd處理下地上部頂端、中部和基部中幾乎所有礦質營養(yǎng)元素的含量都明顯減少(圖3)。例外的是，隨著處理中Cd濃度的升高，地上部頂端的Ca含量以及基部的Mg含量出現了顯著的升高趨勢。200 μmol·L-1處理下，地上部頂端Ca的含量比對照升高了20%，基部Mg的含量則升高了38.1%。

2.4 Cd處理對黃芪幼苗次生代謝的影響

異黃酮和皂苷是黃芪中最受人關注的兩類次生代謝物質，它們在根系中的含量受Cd處理影響發(fā)生了明顯變化(圖4)。與對照相比，較低濃度的Cd處理即引起了毛蕊異黃酮、刺芒柄花素以及毛蕊異黃酮苷和刺芒柄花苷含量的明顯升高。在50 μmol·L-1Cd處理下，4種異黃酮物質的含量都達到最高值，其中毛蕊異黃酮達到了對照的7.2倍。隨著處理濃度的進一步升高，異黃酮含量出現了較為明顯的下降趨勢。與異黃酮的反應不同，Cd處理誘導了根系中黃芪皂苷Ⅰ-Ⅳ含量的顯著降低，并且黃芪皂苷含量下降的幅度受Cd濃度影響的程度遠低于Cd處理本身。

圖4 Cd對黃芪幼苗根系次生代謝的影響Fig.4 The effects of Cd treatments on secondary metabolism in roots of A.membranaceus seedlings

3 討論

作為毒性最大的重金屬元素之一，Cd在較低濃度時就可以引起植物的中毒反應，最為基本的可見癥狀為生長速率的降低以及隨之而來的葉片失綠等[18]。在本研究中，25 μmol·L-1Cd處理7 d后，黃芪幼苗根系伸長生長就受到了顯著抑制，隨著Cd處理濃度的升高，株高以及根系和地上部生物量積累也都明顯降低。此外，Cd處理還降低了黃芪幼苗新生葉片光合色素的含量，導致新生葉片失綠變黃。但是，即使在較高濃度Cd處理下，中下部葉片特別是基部老葉未發(fā)現失綠現象，暗示Cd處理主要抑制了葉綠素的合成而非促進了原有葉綠素的降解。與本結果相一致，有報道認為Cd引起葉綠素下降的原因可能是影響了葉綠素合成途徑的關鍵酶的活性[19]。同時，我們發(fā)現Cd處理下地上部頂端Fe和Mg等與葉綠素合成和活性密切相關的元素含量明顯下降，這可能也是引起葉片變黃的因素之一。

Cd誘導的植物膜系統(tǒng)傷害及其透性增加是其重要的毒害機理之一[20]。我們發(fā)現，Cd處理引起了黃芪幼苗根系的褐變以及MDA含量的明顯增加，顯示Cd處理增加了根系質膜的過氧化程度。隨著膜脂過氧化程度的加劇，多種位于膜上的重要酶的空間結構也隨之遭到破壞，并最終引起膜的空隙和透性增大[21]。干擾植物對礦質營養(yǎng)元素的吸收和轉運也是造成Cd毒害的原因之一[22]，本研究中Cd處理顯著降低了黃芪根系中K、Ca、Zn、Mn以及地上部幾乎全部種類元素的含量。Cd毒害引起的根系細胞膜系統(tǒng)透性增加導致小分子物質外流，削弱了植物細胞主動吸收礦質元素的作用[25]是其擾亂營養(yǎng)元素吸收的重要機理之一。其它機理則包括Cd2+與礦質營養(yǎng)元素競爭根系質外體陽離子吸收位點以及轉運體蛋白結合位點等[23～24]。

黃芪幼苗在實驗濃度Cd處理下顯現出的受害現象說明其對Cd脅迫的耐受性遠低于十字花科的多種Cd超量積累植物，但是當與其近緣物種苜蓿相比時，它又表現出較高的Cd耐性[26]。限制植物體對Cd的吸收或將進入植物體的Cd區(qū)域化地積累在液泡或代謝活性不旺盛的老舊組織中是植物提高其Cd耐性的重要機制[20,27]。在黃芪幼苗中，黃芪吸收的Cd主要積累在根部，向地上部運輸的能力很低，其TF值最高僅為0.157。此外，黃芪地上部老葉中Cd的含量最高，而新生組織中含量最低。以上結果說明黃芪通過調控Cd的空間分布，最大限度地保護了地上部新生組織，以提高其在Cd處理下存活的能力。

Ca是植物的必需元素，它與Cd具有強烈的位點競爭效應并在維持膜結構穩(wěn)定性方面具有重要作用[28]。Cd處理降低了黃芪幼苗根系以及地上部中下部位的Ca含量，卻提高了地上部頂端的Ca含量，推測此反應可能在保護黃芪地上部新生組織免受更大的Cd2+傷害方面具有積極作用。此外，在植物中Mg2+和Cd2+之間具有很強的拮抗作用，Mg營養(yǎng)的缺乏會大大提高Cd對植物組織的毒害水平[29]。我們發(fā)現，Cd處理下Mg在黃芪地上部的基部發(fā)生了特異性的積累上升，這與Cd在地上部的主要積累部位相一致，我們猜測在老葉中高含量的Mg通過與Cd的拮抗作用一定程度上降低了Cd對老葉的毒害作用，最大限度地維持老葉的基本生理功能。

異黃酮和黃芪皂苷類物質是黃芪藥用中最主要的兩類次生代謝活性物質。研究資料顯示，豆科植物細胞在面對不同環(huán)境刺激時會選擇性地大量積累異黃酮或皂苷類物質，并在其防御反應中起著重要作用[30]。在我們的研究結果中，黃芪面對Cd脅迫時根系中積累了大量的異黃酮類物質，而黃芪皂苷含量則明顯下降，表明黃芪選擇了增加異黃酮而非皂苷類物質的合成來應對所面臨的Cd脅迫。同時，異黃酮類化合物自身還具有有較高的抗氧化活性[31]，所以Cd處理下異黃酮的增加還可能在降低Cd引起的氧化脅迫中發(fā)揮了積極作用。

綜上所述，Cd脅迫可以通過抑制黃芪幼苗根系和地上部生長、阻礙光合色素合成、破壞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性以及干擾礦質營養(yǎng)成分吸收和平衡影響黃芪幼苗的生長發(fā)育，而黃芪幼苗則通過將進入體內的Cd進行區(qū)域化、調控拮抗性礦質元素定向累積、提高異黃酮物質產量等途徑積極響應Cd脅迫，以降低其毒害水平。