延 永，張亦琳，楊蓉蓉，陸海洋，王豆豆，喬 宇

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛，726000)

中藥苦參為豆科植物苦參(Sophoraflavescens)的干燥根[1]，作為傳統(tǒng)中藥入藥，始載于漢代神農(nóng)本草經(jīng)，列為中品，味苦，性寒，具有清熱燥濕，殺蟲利尿的功效，對(duì)熱痢、便血、尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡有良好作用；外用對(duì)皮膚瘙癢、滴蟲性陰道炎也有很好的療效[2]。研究表明，苦參中富含多種具有抑菌活性的黃酮類化合物，吸引了植物學(xué)家關(guān)注，目前已經(jīng)分離得到了108個(gè)黃酮類化合物，其中異戊烯黃烷酮類物質(zhì)有顯著的抗菌作用[3]，對(duì)人骨髓白血病HL-60細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的抑制效果[4]。中藥滴丸制劑已經(jīng)成為國內(nèi)第三代制劑開發(fā)的重點(diǎn)內(nèi)容之一[5]，滴丸劑是在中藥丸劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，具有制備簡便、溶出快、服用方便、降低藥物刺激作用、質(zhì)量易控制的優(yōu)點(diǎn)[6]。近年來，研究滴丸制備工藝和性質(zhì)研究吸引越來越多的科學(xué)家關(guān)注，大量的研究成果涌現(xiàn)，已經(jīng)獲批臨床研究的項(xiàng)目也在不斷增加。目前，滴丸劑的制法可分為下行滴法(懸滴)、上行滴法(躺滴)、定量制丸法、脈沖切法和振蕩制丸法等幾種，其中下行滴法是最簡單、最常用的滴制法[7]。

研究通過對(duì)下行法滴丸制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，希望得到苦參總黃酮濃縮藥液滴丸。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出影響滴丸制備工藝的主要因素，選取合適的因素和條件，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)所得的滴丸進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出最佳工藝。通過制備苦參總黃酮提取物滴丸，解決傳統(tǒng)中藥苦參制劑服用和保存不方便的問題，提高生物利用度，使苦參總黃酮在治療心律失常、糖尿病、高血糖等疾病時(shí)發(fā)揮速效作用，為進(jìn)一步研究苦參總黃酮相關(guān)制劑的藥理作用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦參購于商洛市萬壽堂大藥房，經(jīng)鑒定為真品；PEG4000、PEG6000均為分析純購于無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；氫氧化鈉(片狀)、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸分析純購于四川西隴化工有限公司；蘆丁標(biāo)品購于中國藥品生物制品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6 電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器北京科偉永興儀器有限公司；SI-2002電子天平上海天平儀器廠；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)島津企業(yè)管理(中國)有限公司；DWJSY-1實(shí)驗(yàn)滴丸機(jī)煙臺(tái)博鑫制藥機(jī)械有限公司；ZBS-6E智能崩解儀天津市天大天發(fā)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦參總黃酮的提取工藝

①酸堿滲漉法。準(zhǔn)確稱取苦參藥材粉末2.0 g用0.2%鹽酸溶液浸泡2h，料液比為1:15，轉(zhuǎn)移至滲漏筒中，滲漉時(shí)間24 h，過濾。濾餅用蒸餾水沖洗至流出液呈中性，用10%氫氧化鈉溶液按料液比1:20連續(xù)滲漉36 h，收集滲漉液，調(diào)節(jié)pH至中性，得苦參總黃酮滲漉提取液[10]。

②乙醇回流提取法。準(zhǔn)確稱取苦參藥材粉末2.0 g，加入16 mL的80%乙醇溶液在80℃水浴加熱下回流提取，每次1 h，提取次數(shù)為3次[11]。提取后合趁熱過濾，合并提取液，放冷后減壓濃縮至無醇味，即得苦參總黃酮濃縮藥液。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定 精密稱取蘆丁對(duì)照品0.0203 g，用30 %乙醇溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用30 %乙醇溶液稀釋至刻度搖勻,即得對(duì)照品溶液。精密吸取該試液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，分別加入0.05 mol·L-1的NaNO2試液0.7 mL，使混勻，放置6 min，加入0.1 mol·L-1的Al(NO3)3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入1.0 mol·L-1的NaOH溶液5.0 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，放置15 min測(cè)其吸光度值。以0.0 mL組試劑作空白，于510 nm處測(cè)定其吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)X，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸。

將所得提取液加水定容至100 mL，按上述操作測(cè)量吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮類化合物的濃度，再計(jì)算黃酮得率。計(jì)算公式如下：

式中：Y-黃酮類化合物的總提取率(%)

C-溶液總黃酮濃度(mg·mL-1)

N-稀釋倍數(shù)

V-提取液取樣量(mL)

W-藥材投入粉末質(zhì)量(mg)

1.3.3 滴丸的滴制工藝優(yōu)化(單因素分析) 以苦參總黃酮提取物為活性成份，聚乙二醇4000和聚乙二醇6000混合物為基質(zhì)，石蠟為冷卻液，對(duì)下行法滴丸滴制工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，通過制得滴丸的外觀(硬度、圓整度、拖尾度、黏連度)和丸重變異系數(shù)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]如表1所示，滴丸的丸重評(píng)價(jià)指標(biāo)表[9]如下表2所示，在硬度、圓整度、拖尾度、黏連度等方面符合《中國藥典》要求，以此來確定苦參黃酮滴丸成型的最佳工藝，解決傳統(tǒng)中藥苦參制劑服用和保存不方便的問題，提高其生物利用度。

表1 外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)a,b

a對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的9組結(jié)果進(jìn)行丸重稱量，對(duì)丸重差異檢測(cè)進(jìn)行計(jì)算打分，總得分計(jì)算方法為：外觀總分×(1-丸重變異系數(shù))數(shù)值越大，外觀質(zhì)量越好。

b對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得三組滴丸加權(quán)計(jì)算評(píng)分總得分為:外觀質(zhì)量評(píng)分×0.3+丸重差異×0.3+溶散時(shí)間×0.4，其數(shù)值越小，滴丸質(zhì)量則越好[13]。

表2 滴丸丸重檢查對(duì)照a

a檢査法：取供試品20丸，精密稱定總重量，求得平均丸重后，再分別精密稱定每丸的重量。每丸重量與標(biāo)示丸重相比較(無標(biāo)示丸重的，與平均丸重比較)，按下表中的規(guī)定，超出重量差異限度的不得多于2丸，并不得有1丸超出限度1倍。

①基質(zhì)的選擇。因?yàn)榭鄥⒅刑崛〉目鄥⒖傸S酮的僅微溶于水，所以實(shí)驗(yàn)選用了被廣泛用于制備滴丸的水溶性基質(zhì)PEG4000和PEG6000。設(shè)定基質(zhì)溫度為80℃，冷凝用液體石蠟溫度為10℃，滴速每分鐘20～30滴，滴距為10 cm，冷卻柱高度為65 cm，基質(zhì)分別選用PEG4000，PEG4000：PEG6000=1∶1、1∶2、2∶1，PEG6000五種進(jìn)行滴制。收集制得的滴丸，吸去表面的液體石蠟后，進(jìn)行評(píng)價(jià)。

②提取物與基質(zhì)比例的篩選

設(shè)定PEG4000:PEG6000的比例為1∶1，分別按1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11的比例將基質(zhì)和藥液進(jìn)行熔融混合，其他條件與①一致，進(jìn)行滴制。收集制得的滴丸，吸去表面的液體石蠟后，進(jìn)行評(píng)價(jià)。

③藥液溫度的篩選。PEG4000的熔融溫度為55+2℃，PEG6000的熔融溫度為57+2℃。設(shè)置溫度60℃、70℃、80℃、90℃，兩種基質(zhì)的比例為1∶1，基質(zhì)和藥液的比例為1∶2，其他條件與①一致，進(jìn)行滴制。收集制得的滴丸，吸去表面的液體石蠟后，進(jìn)行評(píng)價(jià)。

④滴距的篩選。以PEG4000和PEG6000為基質(zhì)滴制滴丸滴距一般在4～12 cm，因此，設(shè)置滴距分別為4、6、8、10、12cm，其他條件與①一致，進(jìn)行滴制。收集制得的滴丸，吸去表面的液體石蠟后，進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 滴丸的滴制工藝優(yōu)化(正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)定混合基質(zhì)的比例(A)、藥物與基質(zhì)的比例(B)、混合藥液的溫度(C)、滴距(D)四個(gè)因素為影響因素，充分考慮各因素之間的交叉影響，對(duì)下行法滴制工藝進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過制得滴丸評(píng)分高低，對(duì)下行法苦參滴丸滴制工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

按照上述操作分別測(cè)得不同濃度蘆丁溶液的吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)得吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為,2=0.9996，表明在0～0.04 mg·mL-1范圍內(nèi)其濃度和吸光度值有良好的線性關(guān)系，可用于苦參提取物總黃酮濃度的分析計(jì)算。

2.2 苦參總黃酮的提取工藝

按照1.3.1中的兩種方法提取苦參中的總黃酮提取液，加水定容至100 mL，按1.3.2方法測(cè)得其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中求出藥液濃度，并進(jìn)一步求出總黃酮提取率。酸堿滲漉法總黃酮提取率為0.92 %，乙醇回流提取法總黃酮提取率為2.16%。

表3 總黃酮提取方法比較

由表3可知，乙醇回流提取法在操作時(shí)間上有著明顯的優(yōu)勢(shì)，而且總黃酮提取率高于酸堿滲漏提取法，文獻(xiàn)中提到的提取純度高的優(yōu)勢(shì)并沒有得到體現(xiàn)，因此綜合考慮，選取乙醇回流提取法作為苦參總黃酮的提取方法。

2.3 苦參滴丸的制備工藝優(yōu)化

2.3.1 基質(zhì)配比對(duì)滴丸的影響 由表4可知，基質(zhì)的配比對(duì)滴丸的各項(xiàng)外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)影響較大。選用PEG 4000作為基質(zhì)，所得滴丸硬度較小，不易保存；用PEG6000作為基質(zhì)制備滴丸，制得的滴丸易拖尾，且圓整度較差；兩種基質(zhì)混合后制備的滴丸，外觀良好，基本無粘連現(xiàn)象。

表4 不同基質(zhì)配比的滴丸的評(píng)分

2.3.2 藥物與基質(zhì)配比對(duì)滴丸的影響 由表5可見，當(dāng)藥物與基質(zhì)的比例為1∶3時(shí)混合藥液冷凝后仍為液態(tài)，不成丸型。但當(dāng)藥物與基質(zhì)的比例變?yōu)?∶5～1∶11時(shí)，藥液的與基質(zhì)很容易混合均勻，制得的滴丸各項(xiàng)指標(biāo)均良好。

2.3.3 藥液混合溫度對(duì)滴丸評(píng)分的影響 由表6可見，當(dāng)藥液混合溫度為60℃時(shí)，藥液粘稠度較高，流動(dòng)性差，無法滴制。溫度大于70℃時(shí)各組藥物粘稠度適中，制得的滴丸均具有良好的外觀，且表面光滑度較高。

表5 藥物與基質(zhì)配比對(duì)滴丸評(píng)分的影響

表6 藥液混合溫度對(duì)滴丸評(píng)分的影響

2.3.4 滴距對(duì)滴丸評(píng)分的影響 如表7所示，當(dāng)?shù)尉嘣谳^大或者較小時(shí)，滴丸的總分較低。滴距在6～8 cm時(shí)外觀評(píng)分較高，各滴距制得的滴丸光滑度均較高，各丸粒之間無粘連，無明顯拖尾現(xiàn)象。

2.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及其評(píng)分結(jié)果，選定各因素條件表8所示，結(jié)合正交表、進(jìn)行各因素的正交實(shí)驗(yàn)，制備不同工藝條件下的滴丸。所得滴丸吸去表面的液體石蠟后晾干，進(jìn)行分析評(píng)分。

表7 滴距對(duì)滴丸評(píng)分的影響

表8 正交試驗(yàn)因素

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表9所示，總黃酮滴丸的最佳工藝為：A2B2C3D3。即基質(zhì)配比(PEG4000:PEG6000)為1:2，藥液與基質(zhì)配比為1:9，溫度為90℃，滴距為10 cm。第1組和第9組實(shí)驗(yàn)所得滴丸嚴(yán)重粘連，已經(jīng)結(jié)成塊狀，故設(shè)丸重變異系數(shù)為100 %。其余各組所得滴丸外觀良好，少數(shù)粘連，丸重分布均勻。

2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證該工藝的可靠性，對(duì)上面的最佳標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行平行三次測(cè)試，結(jié)果如表10所示。所得的三個(gè)批滴丸外觀良好，重量均在0.03 g左右，丸重差異和溶散時(shí)間符合《中國藥典》(2015版)要求，含藥量為約為0.014 mg，表明該工藝用于制備苦參滴丸穩(wěn)定、可靠。

表10 最佳工藝制備滴丸評(píng)分

3 結(jié)論

(1)研究篩選了兩種總黃酮的提取方法，通過綜合比較，選出提取率較高、操作周期短的乙醇回流提取法作為提取苦參總黃酮的方法。

(2)通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響苦參總黃酮滴丸制備的四個(gè)因素進(jìn)行篩選，得到合適的比例，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的制備工藝為：A2B2C3D3，即基質(zhì)配比(PEG4000∶PEG6000)為1∶2，藥液與基質(zhì)配比為1:9，溫度為90℃，滴距為10 cm。所得滴丸每丸重0.03 g左右，每丸含藥量約為0.014 mg，滴丸外觀、丸重差異、溶散時(shí)限均符合《中國藥典》(2015版)的要求。經(jīng)過平行3次驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該工藝穩(wěn)定、有效，可以用于苦參滴丸的制備，解決了傳統(tǒng)中藥苦參制劑服用和保存不方便的問題，提高其生物利用度。