(天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系，天津 300070)

在生理學(xué)、病理生理學(xué)及藥學(xué)等學(xué)科的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，蛙心灌流是觀察神經(jīng)體液因素及藥物對心臟活動的影響最常用的實(shí)驗(yàn)方法。當(dāng)前蛙心插管的方法主要是斯氏法[1-3]，結(jié)扎右主動脈，在左主動脈將插管經(jīng)動脈圓錐插入心室內(nèi)。但是該方法常造成動脈圓錐損傷，而影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行[4-5]。蛙心灌流實(shí)驗(yàn)中插管的方法除了斯氏法，還有八木氏法、右主動脈插管、后腔靜脈+左主動脈插管[6-8]。本研究旨在探討多種蛙心灌流插管方法的優(yōu)缺點(diǎn)，從而選出更為合適的蛙心灌流插管方法用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

牛蛙60只，體質(zhì)量150～180 g，雌雄不限，由天津醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

手術(shù)器械、蛙板、蛙心插管、動脈導(dǎo)管、靜脈導(dǎo)管、結(jié)扎線、任氏液及鐵架臺等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將60只牛蛙隨機(jī)分為4組：斯氏法組、八木氏法組、右主動脈插管組及后腔靜脈+左主動脈插管組，每組15只動物。用探針搗毀牛蛙的腦和脊髓，以四肢松軟無肌張力為適度，仰臥位固定在蛙板上，打開胸腹腔，用眼科剪剪開心包膜，充分暴露心臟和相連的血管，然后分別用四種方法進(jìn)行插管，使心臟離體。記錄蛙心插管的時間、心臟離體時間、平均存活時間、插管成功率(%)、離體蛙心存活率(%)、凝血率(%)等指標(biāo)。

1.3.1 斯氏法

右主動脈下穿一線并直接結(jié)扎右主動脈；結(jié)扎左主動脈遠(yuǎn)心端，在近心端穿一根線備用。心臟插管：用眼科剪在左主動脈近心端剪一“V”字型切口，左手提起遠(yuǎn)心端結(jié)扎線，右手拇指堵住插管口，將裝有任氏液的蛙心插管沿血管方向由切口插入動脈腔內(nèi)，當(dāng)插管尖端推到動脈圓錐時稍向后退，轉(zhuǎn)入動脈圓錐方向，輕輕轉(zhuǎn)動插管，將插管緩慢向心室方向推進(jìn)。待心室收縮沿心室后壁方向插入心室，此時可見插管內(nèi)液面隨心室的收縮而上下浮動表明插管成功，將備用線結(jié)扎在插管上，并固定在插管的側(cè)鉤上，用新鮮任氏液沖洗插管3～5次，將心室內(nèi)血液置換干凈。將各靜脈進(jìn)行結(jié)扎，注意勿結(jié)扎靜脈竇，剪斷各血管，使心臟離體。

1.3.2 右主動脈插管

直接結(jié)扎左主動脈；結(jié)扎右主動脈遠(yuǎn)心端，在近心端穿一根結(jié)扎線備用。在右主動脈根部剪一“V”字型切口，將蛙心插管由切口插入血管并慢慢向前推進(jìn)經(jīng)過動脈圓錐，當(dāng)心室收縮主動脈瓣打開時插入心室，判斷插管成功的標(biāo)準(zhǔn)同斯氏法，用備用線結(jié)扎固定插管，用任氏液置換心室內(nèi)的血液。結(jié)扎各個靜脈，注意勿傷及靜脈竇，剪斷各血管，使心臟離體。

1.3.3 八木氏法

同斯氏法暴露心臟，穿線結(jié)扎右主動脈、前腔靜脈和肺靜脈。靜脈插管：在左右肝靜脈和后腔靜脈下穿線備用，在左肝靜脈遠(yuǎn)心端向心臟方向剪一“V”字型切口，將裝有任氏液的靜脈插管向心插入，當(dāng)心臟膨大變白時表明插管成功，結(jié)扎固定靜脈，并用新鮮任氏液置換心臟內(nèi)血液。左主動脈插管：結(jié)扎左主動脈遠(yuǎn)心端，在近心端穿一根線備用，在動脈遠(yuǎn)端向心臟方向剪一“V”字型切口，插入動脈插管，其前端不進(jìn)入動脈圓錐，當(dāng)插管內(nèi)灌流液流出，結(jié)扎固定插管，形成開放性循環(huán)回路。剪斷其他各血管及組織使心臟離體。

1.3.4 后腔靜脈+左主動脈插管法

方法同八木氏法，但靜脈插管是對后腔靜脈進(jìn)行插管，動脈插管是左主動脈插管，同樣不進(jìn)入動脈圓錐。插管完成后，剪斷與蛙體相連的各血管，使心臟離體。

1.4 觀察內(nèi)容

(1)蛙心插管所需時間：從各靜脈或動脈穿線到心臟固定所用時間。(2)心臟離體時間：從取牛蛙開始到心臟完全離體時間。(3)插管成功率：單插管法為套管進(jìn)入心室，套管內(nèi)液面上下波動，雙插管法為刻度蛙心套管進(jìn)入靜脈，動脈插管進(jìn)入主動脈，形成開放循環(huán)回路即為插管成功，插管成功數(shù)占實(shí)驗(yàn)總數(shù)的比率。(4)存活率：心臟存活占插管成功數(shù)的比率。(5)平均存活時間：蛙心離體到蛙心停止跳動的時間。(6)凝血率：出現(xiàn)凝血現(xiàn)象的蛙心占插管成功蛙心的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 4種方法插管時間、標(biāo)本離體時間及標(biāo)本存活時間比較

與傳統(tǒng)插管方法即斯氏法相比，八木氏及后腔靜脈+左主動脈法所需的插管時間及蛙心離體時間都顯著延長(P<0.05)，離體蛙心存活時間也顯著延長(P<0.05)；右主動脈插管法插管所需時間較斯氏法要明顯縮短(P<0.05)，蛙心離體時間略縮短(P>0.05)，離體蛙心平均存活時間明顯延長(P<0.05)。

表1 4種插管方法的插管時間、心臟離體時間及平均存活時間比較

與斯氏法相比，aP<0.05；與右主動脈插管相比，bP<0.05。

2.2 4種方法插管成功率、存活率及凝血率比較

八木氏法及后腔靜脈+左主動脈兩種雙插管法及右主動脈插管法的插管成功率及標(biāo)本存活率顯著高于斯氏法(P<0.05)，三種插管方法的凝血率明顯低于斯氏法(P<0.05)。和兩種雙插管法相比，右主動脈插管法的成功率降低(P<0.05)，離體蛙心的存活率略低(P>0.05)，凝血率升高(P<0.05)。

表2 4種插管方法的插管成功率、存活率及凝血率的比較

與斯氏法相比，aP<0.05；與右主動脈插管相比，bP<0.05。

3 討論

在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥學(xué)等諸多學(xué)科的教學(xué)及科研中廣泛用到離體蛙心灌流系統(tǒng)來研究心臟的功能活動，而蛙心插管是蛙心灌流實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的也是最難操作的步驟。在本教研室開展的離體蛙心灌流實(shí)驗(yàn)中，采用的傳統(tǒng)插管方法即斯氏法。斯氏法是插管插入左主動脈,再經(jīng)過動脈圓錐插入心室，而左主動脈的走向和動脈圓錐進(jìn)入心室的走向不一致，因此插管向心插入左主動脈盡頭后需向后適當(dāng)后退，再插入動脈圓錐，此時插管的尖端面對的是管壁較薄且沒有貼附組織的動脈圓錐外側(cè)壁，易造成心臟的左右移動，使插管不易進(jìn)入心室；且易造成動脈圓錐的損傷；插管時間延長也會造成心肌功能的損傷，最終造成動物浪費(fèi)及實(shí)驗(yàn)失敗。和斯氏法相比，右主動脈插管的優(yōu)點(diǎn)有：(1)從蛙心解剖特點(diǎn)上，右主動脈和動脈圓錐進(jìn)入心室方向一致，有利于插管經(jīng)動脈圓錐進(jìn)入心室；(2)經(jīng)右主動脈插管管尖面對的是動脈圓錐的內(nèi)側(cè)壁或半月瓣，動脈圓錐內(nèi)側(cè)壁后端貼附于左右心房，因此插管時蛙心不會出現(xiàn)前后或左右移動，有利于插管進(jìn)入心室；(3)對動脈圓錐損傷較斯氏法小，能夠降低心臟功能受損；(4)對動脈圓錐損傷小，凝血率降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示右主動脈插管較斯氏法，插管所需時間顯著減少，成功率、存活率、標(biāo)本存活時間顯著提高，凝血率顯著降低。因此右主動脈插管法較斯氏法有較大優(yōu)勢。

八木氏法是對左肝靜脈和左主動脈分別進(jìn)行插管，且動脈插管僅插入左主動脈并不經(jīng)過動脈圓錐進(jìn)入心室；后腔靜脈+左主動脈插管也是雙插管法，同八木氏法相同，其動脈插管不進(jìn)入心室。因此相對斯氏法，兩種雙插管方法的優(yōu)點(diǎn)是：(1)不損傷動脈圓錐，不損傷心臟功能；(2)凝血率顯著降低；(3)灌流液從動脈出來進(jìn)入靜脈，形成循環(huán)回路，符合生理狀態(tài)的單向流動規(guī)律[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，雙插管法較斯氏法，插管成功率、存活率及標(biāo)本存活時間都明顯提高，凝血率明顯降低。但雙插管法的缺點(diǎn)就是要分別分離出靜脈動脈，并進(jìn)行插管，操作較復(fù)雜，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雙插管法的插管所需時間和標(biāo)本離體時間都顯著長于斯氏法。

綜合4種插管方法的比較，本研究認(rèn)為，若僅研究某些因素對心肌收縮功能等簡單實(shí)驗(yàn)時，可采用右主動脈插管法；若需研究心臟前負(fù)荷、后負(fù)荷等對心輸出量的影響等心臟循環(huán)功能實(shí)驗(yàn)時，則可采用雙插管法。