高榮，李子晗，馬錦榮，何濤，方怡，鄭蕾

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021）

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，從天然藥物中篩選具有抗癌活性成分受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。目前，抗癌中藥及其制劑的開發(fā)已成為我國(guó)抗癌藥物研究的重要方向[1]。

木鱉子 [學(xué)名:Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.]為葫蘆科苦瓜屬植物木鱉的干燥成熟種子[2-3]，具有攻毒散積、疏結(jié)消散之功。已經(jīng)報(bào)道的木鱉子中含有甾體類、三萜及其苷類、烯烴類、氨基酸類和有機(jī)酸等，可用于抗癌、抗菌、抗過敏、鎮(zhèn)痛的治療。木鱉子曾作為抗癌中藥制劑楓苓合劑的君藥，經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)有顯著的抗癌作用，并且在治療肝癌、胃癌的臨床試驗(yàn)中療效良好[4-6]。

細(xì)胞自噬是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種依賴溶酶體的細(xì)胞死亡途徑，胞內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器通過自噬作用被降解，產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等再被細(xì)胞重新利用。誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，可以保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)折疊異常的蛋白和功能異常的細(xì)胞器，從而降低腫瘤的發(fā)生率，然而當(dāng)腫瘤形成，自噬可降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)變形的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，為其生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)及能量，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[7]。自噬的發(fā)生可分為四個(gè)階段:分隔膜的形成、自噬體的形成、自噬體的運(yùn)輸融合和自噬溶酶體的裂解[8]。自噬的調(diào)控因素主要有Beclin1、LC3、mTOR等[9]。

因此，何種藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，成為當(dāng)今腫瘤治療的熱門方向[10]。本次實(shí)驗(yàn)選擇乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30，探究中藥木鱉子是否通過細(xì)胞自噬發(fā)揮其抗癌功效。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人乳腺癌細(xì)胞系ZR-75-30，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

MTT（Sigma）、胎 牛 血 清（HyClone）、RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone）。

倒置顯微鏡（Nikon）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Rad）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試藥提取

稱取木鱉子碾碎后原藥材10 g，加入100 mL雙蒸水，浸泡過夜，水浴回流提取兩次，每次1.5 h，合并上清液，加入3%活性炭，80℃蒸煮脫色30 min，以8000 r/min離心 10 min，收上清液蒸發(fā)干燥，得到木鱉子水提取物（CMSWE），4℃保存。用時(shí)DMSO溶解為 0.1 g/mL，保存于 4℃冰箱。

1.2.2 MTT法

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ZR-75-30細(xì)胞消化稀釋濃度4×104mL-1于96孔板，隔日加入不同濃度藥液，48h后取出，加入MTT，4 h后加入150 μL DMSO使甲臜溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定每孔吸光度（OD）。

1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ZR-75-30細(xì)胞消化稀釋濃度1×103mL-1于6孔板，隔天加入不同濃度的藥物。15天后每孔用甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用PBS洗兩次進(jìn)行拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ZR-75-30細(xì)胞消化稀釋濃度 3×105mL-1，加藥后培養(yǎng) 48 h，消化細(xì)胞，放置染色1 h，濾網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 熒光染色技術(shù)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ZR-75-30細(xì)胞消化稀釋濃度2×104mL-1于6孔板，隔天加入不同濃度的藥物。48 h后用單丹黃酰尸胺（MDC）染色，顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western雜交

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ZR-75-30細(xì)胞消化稀釋濃度4×104mL-1于 6孔板，隔日加入不同濃度藥液，48h后取出，收集并裂解，雙縮脲法測(cè)定各樣本蛋白濃度。按比例與上樣緩沖液混勻，煮沸5min，得蛋白樣本。10%丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，適當(dāng)比例稀釋的抗體孵育，顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析各蛋白條帶光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 木鱉子對(duì)ZR-75-30細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖1可得隨著給藥濃度的增大，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也逐漸增大。

圖1 木鱉子對(duì)ZR-75-30細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖2可得，給藥濃度A-C組逐漸增大，A組為空白組，由圖可見，隨給藥濃度增大，細(xì)胞形成集落越弱。

圖2 木鱉子對(duì)ZR-75-30細(xì)胞集落形成的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)

由圖3可以看出，被熒光染色的細(xì)胞占總收集細(xì)胞的比例由0.7%、8.0%、18.5%到22.6%逐漸增加，說明自噬情況逐漸加強(qiáng)。可得結(jié)論:中藥木鱉子可以促進(jìn)ZR-75-30細(xì)胞發(fā)生自噬，并且隨給藥濃度的增大，細(xì)胞發(fā)生自噬的能力逐漸增強(qiáng)。

圖3 木鱉子對(duì)ZR-75-30細(xì)胞自噬作用的影響

2.4 MDC染色法

MDC染色部分表示了自噬小體，由圖4看出綠色熒光逐漸增強(qiáng)，表示自噬小體的數(shù)目隨給藥濃度的增加而增多，說明木鱉子給藥濃度越大，促進(jìn)自噬能力越強(qiáng)。

圖4 MDC熒光染色圖

2.5 Western雜交

LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值大于1時(shí)存在自噬，由圖5可見，空白組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值接近1，隨給藥濃度增大LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐漸增大，同時(shí)自噬正調(diào)控蛋白BECN1含量隨給藥濃度增大而增大。由此可得結(jié)論，中藥木鱉子可以促進(jìn)細(xì)胞自噬，且呈濃度依賴性，給藥濃度越大，細(xì)胞發(fā)生自噬程度越大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究中藥木鱉子促進(jìn)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞自噬研究，通過MTT法、集落形成實(shí)驗(yàn)可確定中藥木鱉子對(duì)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。通過熒光染色（MDC）、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡技術(shù)可以明確中藥木鱉子促進(jìn)細(xì)胞自噬的能力呈濃度依賴性。

綜上，推測(cè)木鱉子可能通過自噬作用抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，我們將通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究木鱉子促進(jìn)自噬的機(jī)制。